エピジェネティクスにおけるフローサイトメトリーの使用

エピジェネティクスとフローサイトメトリーを組み合わせた時

DNAからRNA、タンパク質へのセントラルドグマは、20世紀半ばに導入されて以降、次第に時代遅れになっています。発現、RNAプロセシング、翻訳の調節におけるメカニズムは、タンパク質がどのようにして作られ、調節されているかについてのより複雑な図式を明らかにしています。遺伝子調節の主要なメカニズムの1つは、エピジェネティクスであり、DNA塩基の変化を伴わない遺伝因子の研究です。顕著なエピジェネティックのメカニズムには、転写装置へのアクセスを変化させるDNAメチル化やヒストン修飾などがあります。この分野は、癌、神経科学、開発などに幅広く応用されています。

エピジェネティックの見識を免疫学に応用することは困難であることが証明されています。ChIPおよびウエスタンブロットのような標準的なアプリケーションは、集団レベルの情報を提供しますが、免疫学は、造血系における細胞型の複雑なマップの研究によって推進されています。 フローサイトメトリーは、単一細胞を分析できるため、造血系を理解する上で非常に貴重な資源であることが証明されていますが、細胞マーカーと組み合わせてエピジェネティックマークを研究するには、慎重な検討および実験計画が必要です。

エピジェネティックマークを使用したフローサイトメトリーに関する実験的考察

第一の考察は、従来の細胞表面マーカーと比較して、エピジェネティックマークの量が少ないことを克服するための、強いシグナルを有する複合体についてです。 フィコエリトリン(PE)は、蛍光に基づく技術のシグナル強度のために一般的な選択であり、ツリウム‐169は、マスサイトメトリーアプリケーションに推奨されます。もう一つの問題は、細胞表面マーカー抗体と核アクセスに必要な透過化剤との適合性です。 たとえば、メタノールは、エピトープに損害を与える可能性があるので、実験前にすべての抗体を再確認する必要があります。ダブレットイベントを予防するため、バーコード化も推奨されます。最後に、適切な定量には、汎ヒストン抗体を用いた総ヒストン量の内部統制が必要です。

エピジェネティック試薬の検証

エピジェネティックフローサイトメトリーの課題は、エピジェネティックマークに特異的なだけでなく、フローに適した抗体を見つけることです。 これらの抗体を試験する最良の方法は、薬理学的または遺伝学的方法で陽性および陰性対照を用いることです。エピジェネティックマークの存在量は、DNA損傷などの特定の刺激によって誘発されることがあり、これにより追加的な検証方法を提供することができます。

この方法を免疫学研究に適用

エピジェネティックフローサイトメトリーは、既に興味深い洞察をもたらしています。 Cell、Cheungらの執筆(PMID:29706550)では、この方法を用いて老化を調査しました。本研究に先立ち、加齢が造血系、特に各免疫細胞種のエピジェネティックプロファイルにどのように影響するかは不明でした。

マスサイトメトリーを用いて、20種類以上の免疫細胞種にわたってヒストン変異体および修飾を解析したところ、若年者は細胞間およびヒト-ヒトの両面から類似したエピジェネティックプロファイルを有することがわかりました。しかし、老化の間、細胞間およびヒト‐ヒト間への不均一性が増加します。ヒトの双生児サンプルでも同様の結果が得られていることから、ばらつきは環境の影響によるものであることが示唆されます。さらに、免疫細胞型は、エピジェネティックプロファイルのみで予測することができました。全体として、彼らの研究は、フローサイトメトリーとエピジェネティクスを組み合わせることの力を実証しています。

フローサイトメトリーを用いたエピジェネティックにおいて、次の大きな発見はどのようにして見つかるでしょうか。プロテインテック社の主なエピジェネティック関連抗体をご覧ください:

カタログ番号 クローン 抗原名 KD/KO アプリケーション 反応性 文献
10745-1-AP ポリクローナル NF-κB p65 KD/KO validated WB, IP, IHC, IF, FC, chIP, ELISA ヒト、マウス、ラット、ブタ 451
10442-1-AP ポリクローナル P53 KD/KO validated WB, IP, IF, CoIP, chIP, ELISA ヒト、ラット、マウス 383
51067-2-AP ポリクローナル Beta Catenin KD/KO validated WB, IP, IHC, IF, chIP, ELISA ヒト、マウス、ラット、ブタ 263
10828-1-AP ポリクローナル c-MYC KD/KO validated WB, IP, IF, FC, CoIP, chIP, ELISA ヒト、マウス 207
10638-1-AP ポリクローナル REDD1 specific KD/KO validated WB, IP, IHC, IF, chIP, ELISA ヒト 185
20960-1-AP ポリクローナル HIF1a KD/KO validated WB, IP, IHC, IF, FC, CoIP, chIP, ELISA ヒト 169
15204-1-AP ポリクローナル CHOP; GADD153 KD/KO validated WB, IHC, IF, FC, ELISA ヒト、マウス、ラット 160
10835-1-AP ポリクローナル ATF4 KD/KO validated WB, IP, IHC, IF, FC, ELISA ヒト、マウス、ラット 145
12892-1-AP ポリクローナル TDP-43 (C-terminal) KD/KO validated WB, IP, IHC, IF, chIP, ELISA ヒト、マウス、ラット 10

 


参考文献:

  1. Cheung P, Vallania F, Dvorak M, Chang SE, Schaffert S, Donato M, Rao AM, Mao R, Utz PJ, Khatri P, Kuo AJ. Single-cell epigenetics - Chromatin modification atlas unveiled by mass cytometry. Clin Immunol. 2018 Nov;196:40-48. doi: 10.1016/j.clim.2018.06.009. Epub 2018 Jun 28. PMID: 29960011; PMCID: PMC6422338.
  2. Cheung P, Vallania F, Warsinske HC, Donato M, Schaffert S, Chang SE, Dvorak M, Dekker CL, Davis MM, Utz PJ, Khatri P, Kuo AJ. Single-Cell Chromatin Modification Profiling Reveals Increased Epigenetic Variations with Aging. Cell. 2018 May 31;173(6):1385-1397.e14. doi: 10.1016/j.cell.2018.03.079. Epub 2018 Apr 26. PMID: 29706550; PMCID: PMC5984186.
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Posted:
9 November, 2020

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