ゲスト寄稿 | ウェスタンブロットにおけるローディングコントロール

ウェスタンブロットにおけるローディングコントロール実験を解説します。

Deborah Grainger著

内在性コントロールまたは内部標準の役割を通常果たすタンパク質やペプチドは、必ずしも研究の中心的な役割を果たしていないかもしれませんが、有意義な実験を行うためには欠かせないものであり、発表には欠かせないものとなっています。

ウエスタンブロッティングでは、このようなコントロールが必須です。これは、異なる実験パラメータでのタンパク質レベルの半定量に広く使用されています。ウエスタンブロッティングの結果を理解するためには、タンパク質スタンダードが必要となります。また、標的タンパク質の増減は実際に実験操作に起因するものであるかどうか、例えば、ゲルローディング中にサンプルがふらついたためではないことを確認するのに必要なものです。内部標準タンパク質(すなわち、濃度が一定で不変のタンパク質)は通常、関心のあるタンパク質の一次検出に続き、ブロッティングの二次ラウンドで検出されます。このステップは、結果を標準化し、SDS-PAGEでのローディングやウエスタンブロット転写によるサンプルの損失など、ウエスタンブロット実験に忍び寄るあらゆるエラーを正規化するために使用されます。

ウエスタンブロットのローディングコントロール候補は通常、高発現で構成的発現のタンパク質です。上述のように、ローディングコントロールの最も基本的な基準は、使用された組織や細胞の種類、およびそれらの取り扱い方法にかかわらず、実験を通してそのレベルが変化しないことです。つまり、コントロール候補を慎重に選択する必要があることを意味します。よく用いられるβ-アクチンやα-チューブリンなどのローディングコントロールでさえ、実験の条件によって影響を受けることがあります(そのため、選択した操作がそれらに影響を与えないことを再確認してください)。

ここでは、読者の個々のニーズに合わせて最適なコントロールを選択するのに役立つよう、当社が提供するコントロール抗体が標的とする内部標準タンパク質についてそれぞれの背景情報を提供します。

目的のタンパク質と異なる分子量を持つサンプルタイプについてのローディングコントロールを選択するには、下記の概要表を参照してください。

Actin

タイプ: 全細胞/細胞質

分子量: ~42kDa

アクチンの6つのアイソフォームは、α、β、γの3つの主要なアイソフォーム群からなる、高度に保存された球状タンパク質の一群を構成しています。αアクチン、つまり、αC1およびα1とα2は、筋肉組織の収縮装置の主要な構成要素です。ベータ(β)ならびにガンマ1と2(γ1とγ2)の各アクチンは、ほとんどの細胞型で共存し、細胞骨格の重要な一部であり、細胞移動、構造保全、細胞運動性を仲介しています。各アイソフォームを合わせると、アクチンは典型的な真核細胞に最も多く含まれるタンパク質であり、一部の細胞では、全タンパク質の約15%を占めています。そのため、アクチンはウエスタンブロッティング実験の内部標準として広く利用されています。

1:5000の希釈で抗ベータアクチンマウスモノクローナル(60008-1-Ig)を使用した、複数の細胞株および組織溶解物中に存在するACTBのウエスタンブロット分析。

Proteintech社のポリクローナルACTB抗体(20536-1-AP)は、β-アクチンタンパク質抗原(アミノ酸14~167)を用いて生成されたものであり、あらゆる形態のアクチンを認識する、汎アクチン抗体となっています。多くの研究では、このローディングコントロール集団のプローブのために、すべてのアクチンアイソフォームを認識するβ-アクチン抗体が使用されています。しかし、皆さんの研究で、骨格筋の検体を使用した作業を伴う場合、または細胞増殖の変化または細胞外マトリックスとの相互作用の変化を観察する条件で作業している場合は、別のローディングコントロールのほうが、皆さんのニーズに適している可能性があります。

 

HeLa細胞ライセート(10 ug/レーン)をSDS-PAGEで分離し、さまざまな希釈で抗ACTB抗体20536-1-APを用いてアクチンを検出しました。(L-R) 1:500、1:1,000、1:2,000、1:4,000。

 関連抗体

 カタログナンバー

Rabbit   polyclonal ACTB  antibody  20536-1-AP
Mousemonoclonal ACTB  antibody 60008-1-Ig
HRP-conjugated ACTB antibody HRP-60008
Rabbitpolyclonal ACTA1  antibody 17521-1-AP
Rabbitpolyclonal ACTA2  antibody 55135-1-AP

 COX-4

タイプ: ミトコンドリア

分子量: 17kDa

COX-4、またはCOXIV(チトクロームcオキシダーゼサブユニットIV)は、ヒトのミトコンドリア呼吸鎖酵素チトクロームcオキシダーゼ(COX)の核にコードされたサブユニットです。COX-4サブユニットは、それぞれCOX4I1およびCOX4I2と名付けられたアイソフォーム1および2のいずれかのアイソフォームとして発現します。COX4I1の発現はすべての組織で認められますが、COX4I2は肺特異的です。COX4I1は、その安定した高い濃度のため、ミトコンドリアタンパク質の有効なローディングコントロールとして検出されることが一般的です。しかし、SDS-PAGE時に17kDaサイズの場所に泳動されるタンパク質は他にも多くあるため、ウエスタンブロット検出にこのタンパク質を選択する際には若干の注意が必要です(目的のバンドが不明瞭にならないことを確認してください)。また、実験操作がそのレベルに影響を及ぼさないことを二重に確認することをお勧めします。代わりとなるミトコンドリアタンパク質のローディングコントロールについては、以下のVDAC1に関する記録を参照してください。

Proteintech社のCOX4I1抗体(11242-1-AP)は、COX4I1全タンパク質抗原(アミノ酸1~169)に対して生成されており、COX4I2も認識します。

関連抗体  カタログナンバー
Rabbit  polyclonal COX4I1  antibody 11242-1-AP
Rabbit  polyclonal COX4I2  antibody 11463-1-AP

GAPDH

タイプ:Whole Cell/cytoplasmic

分子量: 36kDa

一般的にGAPDHとして知られているグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼは、解糖の第6段階を触媒します。また、転写、RNA結合と輸送、DNA複製と修復、およびアポトーシスなどの核の事象にも関与します。その発現は、ほとんどの組織や細胞型において高く、一定であり、この遺伝子とタンパク質産物はハウスキーピング遺伝子/タンパク質とされています。このため、GAPDHはウエスタンブロッティングのタンパク質ローディングコントロールおよびRT-PCRの内部標準としてよく用いられています。しかし、GAPDHの発現量は、組織によって異なるものもあり、このターゲットをコントロールとして選択する前に、その実験に対する適合性を考慮する必要があります。また、低酸素症や糖尿病のようないくつかの生理的要因が、特定の細胞および組織型でGAPDH発現を増加させることも注目に値します。

Proteintech社では、モノクローナルGAPDH抗体(6004-1-lg) とポリクローナルGAPDH抗体(10494-1-AP)の両方を揃えており、いずれもヒト由来の全タンパク質抗原(アミノ酸1~335)に対して産生されます。

種々の希釈で抗GAPDH (10494-1-AP) を用いた、Hela細胞ライセートのウエスタンブロット(L-R:1:2000、1:4000、1:8000、および1:16000)。

GAPDH 抗体 カタログナンバー
rabbitpolyclonal GAPDH  antibody 10494-1-AP
Mousemonoclonal GAPDH  antibody 60004-1-Ig
HRP-conjugated GAPDH  antibody HRP-60004

Lamin B1

タイプ: Nuclear

分子量: 66kDa

ラミンは、核膜の核質側の下にある密な繊維層である核ラミナの不可欠な構成要素です。ラミンは、クロマチンとの相互作用および遺伝子発現だけでなく、核の構造保全およびその移動制御においても重要な役割を果たしています。脊椎動物のラミンは、A型とB型の2種類で構成されています。LMNB1遺伝子は、2つのB型タンパク質の1つであるラミンB1をコードしており、核画分を扱う際のローディングコントロールとして使用することができますが、このタンパク質は核膜が除去された検体には適していません。また、ラミナマトリックスが可逆的に分解される有糸分裂時に、ラミンは、リン酸化されることも注目に値します。Proteintech社のLMNB1抗体(12987-1-AP)は、タンパク質抗原(C末端のアミノ酸236~586)に対して産生され、ウエスタンブロット、IHC、ELISA、および免疫蛍光法での使用が検証されています。

Lamin 抗体 カタログナンバー
Rabbitpolyclonal LMNB1 antibody 12987-2-AP
Rabbitpolyclonal LMNA/C antibody 10298-1-AP

PCNA

タイプ: Nuclear

分子量: 36kDa

P殖細胞核抗原(PCNA)は、DNAポリメラーゼδのプロセシビティー因子であり、リーディング鎖の伸長時にポリメラーゼのヌクレオチドプロセシング能力を高めることで、真核生物のDNA複製の制御に役立ちます。PCNAタンパク質は進化を通じて高度に保存されており、ラットとヒトのアミノ酸配列は、261アミノ酸のうちわずか4アミノ酸が異なるだけです。これは、全タンパク質を用いて作製したPCNAを標的とする抗体は、複数の種で機能するはずであることを意味します。

PCNAのレベルは、哺乳類細胞の細胞周期によって変化しないものの、増殖中の細胞ではより存在量が多いため、PCNAは主に、増殖中の細胞集団におけるローディングコントロールとして用いられます。PCNAはDNA損傷経路が活性化されると速やかに分解されるので、DNA損傷を誘発する実験では、PCNAを避けるのが最善の策です。

Proteintech社のPCNA抗体は、アミノ酸8~256を含むヒトPCNAの内部領域に対して作製したウサギポリクローナル抗体です。

1:50希釈のPCNA抗体10205‐2‐APとFITC標識ロバ抗ウサギIgG (緑色) を用いたHepG2細胞におけるPCNAの免疫蛍光分析。

PCNA 抗体 カタログナンバー
Rabbitpolyclonal PCNA  antibody 10205-2-AP
Mousemonoclonal PCNA  antibody 60097-1-Ig

Tubulin

タイプ: Whole cell/cytoplasmic

分子量: 50-55kDa

チューブリンは、細胞内の主要な輸送ネットワークである微小管の主要な構成要素です。微小管は、有糸分裂および輸送イベントから細胞移動および細胞形状の維持に至るまで、さまざまな細胞活動に関与しています。チューブリンは種を超えて安定して高発現し、保存されているため、ウエスタンブロッティングでは全細胞または細胞質画分のローディングコントロールとして優れています。しかし、チューブリンの発現量は、抗菌薬や有糸分裂阻害薬に対する耐性によって異なる場合があります。

Proteintech社は、いくつかのチューブリンサブユニットに対するポリクローナル抗体を保有しており、その中にはαチューブリン抗体 (11224-1-AP) と2つのβ-チューブリン抗体10068-1-APおよび10094-1-APが含まれています。

Tubulin 抗体 カタログナンバー
Rabbitpolyclonal alpha tubulin  antibody 11224-1-AP
Rabbitpolyclonal beta tubulin  antibody(antigen: amino acids 43-258) 10068-1-AP
Rabbitpolyclonal beta tubulin  antibody (antigen: amino acids 57-294) 10094-1-AP
HRP-conjugated TUB1A  antibody HRP-66031

 

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Posted:
2 February, 2016

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