中身が見たくてたまらない:オルガネラの染色

オルガネラの内部を可視化することで、オルガネラの分子機構を理解し、細胞の異常を研究することができます。


まず、オルガネラとは何でしょうか?オルガネラは、真核細胞および原核細胞の細胞質に位置する小さな細胞内の構造で、より複雑な真核細胞では、オルガネラは、多くの場合、独自の膜に囲まれています。各オルガネラは、臓器が体のために働くのと同じように、その細胞に特化した機能を果たします。

オルガネラに特異的なタンパク質マーカーを使用するだけでなく、オルガネラに選択的な色素を使用して、関心のある構造を強調することもできます。以下では、個々の細胞オルガネラを識別する際の染色方法をまとめています(図1)。

図1.オルガネラ特異色素で染色できる、複数の主要なオルガネラを強調した動物細胞。

色素を選ぶ前の4つの検討事項:

各オルガネラで利用できるさまざまな染料について説明する前に、染色から最良の結果を得るための、いくつかの考慮するべきポイントがあります。

1.色素の膜透過性を考慮する

DAPIは、膜透過性が低く、固定細胞の染色に適しています。Hoechst(例えば、33342)は、より高い膜透過性を有し、生細胞でも使用することができます。

2.蛍光波長を考慮する。

例えば、緑色のチャンネルで発光する二次抗体を用いて、脂質膜で興味のあるタンパク質を同定する場合は、遠赤色のチャンネルで発光する脂質色素を選択した方が良いです。そうすれば、お互いに干渉しないようにすることができます。

3.色素の濃度を決定することが非常に重要

濃度が低すぎると強い可視化はできませんし、濃度が高すぎるとサンプルに毒性を与えます。

4. 色素の仕組みを正確に理解する

ローダミンのようなミトコンドリア色素は、膜電位に依存します。これらは、生細胞にしか適用できないため、健康や細胞の生存率を解析するための有用なツールとなっています。リソソーム色素が正しく機能するためには、このオルガネラの酸性環境が必要です。また、これらは生細胞で最もよく作用します。

オルガネラごとに異なる染料

1. 形質膜とゴルジ複合体

細胞全体は、リン脂質二重層で囲まれており、細胞質内にはいくつかのメンブレンネットワークが存在しています。形質膜の選択的な透過性と小胞の形成は、細胞内の内部環境やタンパク質の輸送を制御するために不可欠です。

色素の膜透過性を考えてみてください。膜メンブレンは、糖の特定の部分を認識して結合する炭水化物結合タンパク質であるレクチンで染色することができます。

小麦胚芽凝集素(WGA)などのレクチンは、形質膜だけでなく、細胞内タンパク質処理に関与する多くの膜嚢や小胞で構成されるオルガネラであるゴルジ体をも染色します。いずれの構造もリン脂質二重層から形成されており、レクチンを用いて染色することができます。

注記:レクチンの中には、特定の糖脂質や糖タンパク質に特異的なものがあります。これは、複数の細胞をイメージングする際に非常に有用です。例えば、レクチンIsoB4は、内皮細胞の基底膜に結合することにより、内皮細胞を特異的に染色します。

2. ERと脂肪滴

小胞体(ER)は、核膜と連続したもう一つの膜システムで、脂質やタンパク質の処理に関与しています。ERのチューブ状のシステインおよび扁平なシートは、細胞全体の体積の約10%を占める場合があります。ERは、粗面ER(リボソームと関連し、タンパク質産生に関与する)と滑面ER(リボソームとは関連せず、脂質代謝に関与する)に分類されます。ナイルレッドのような色素は、脂質滴に結合し、細胞内の脂質滴とともに親油性のすべての膜を染色しますが、多くのバックグラウンド染色を示すことがあるので、慎重に最適化してください。

注記: 脂質特異的色素で染色する前にオレイン酸で細胞を処理すると、脂質滴の形成が誘導されます。染色がうまくいっているかどうかを確認するための陽性対照としても使えます。

3. リソソーム

リソソームは、細胞の消化系と形容されており、分解酵素を含んでいます。これらの酵素の機能を維持するためには、細胞質ではpHを中性にしますが、それとは対照的に、リソソソームは、酸性条件(pH5程度)に保たれなければなりません。つまり、リソソームは、細胞質からのプロトンの積極的な輸送を必要とすることを意味します。酸性環境下で特異的に作用し、pH勾配を介してリソソームに蓄積する細胞透過性色素を使用するのが最適です。

注記:ニュートラルレッドなどのリソソーム色素は、このオルガネラの酸性環境を必要とし、生細胞で最も効果を発揮します。ただし、ご自分で色素を追加し、次いで細胞を固定することができることを覚えておいてください。これにより、後でタンパク質特異的抗体の添加が可能になります。

4. ミトコンドリア

ミトコンドリアは細胞の動力源として知られています。 酸化的リン酸化過程で生存に必要なエネルギーのほぼ90%を産生し、アポトーシスのキープレーヤーにもなっています。これらは、プロトン勾配を利用してATPを生成し、それを中間エネルギー貯蔵庫として利用する2つの膜を持っています。この膜電位により、ローダミンなどのミトコンドリア色素の使用が可能となり、生細胞での細胞の健康状態や生存率の解析に有用なツールとなります。ただし、膜電位が低下するため、固定直前にしか適用できません。

注記: ローダミンは毒性があり、ミトコンドリアの機能を阻害します。

5. 微小管

微小管は、アクチンおよび中間フィラメントとともに細胞骨格を形成する細胞の構造成分の一つです。微小管は、厳密にはオルガネラではありませんが、細胞を支配する基本的なプロセスを理解する上で重要であり、細胞全体を可視化する際にも役立ちます。これらは、チューブリン色素を用いて特定することができ、特定の結合親和性に応じて微小管ダイナミクスに影響を与え、有糸分裂を停止させる可能性があります。

注記:パラホルムアルデヒド固定ではなく、メタノール固定を行ってください。これにより、架橋タンパク質との干渉が回避され、より質の高い画像が得られます。

図2.FIS1抗体とαチューブリン抗体を用いた4% PFA固定HepG2細胞の免疫蛍光分析。   緑:FIS1(10956-1-AP);赤:αチューブリン(66031-1-Ig)

使用した色素を信頼することを忘れないでくださいね!

色素を使用することは、抗体染色と並んで、研究においてオルガネラを視覚化するためのシンプルで効果的な方法です。利用可能なさまざまなオプションを徹底的に調べて、成功への最高のチャンスを確保してください!

一般的な染色のヒントと複数の免疫染色手法の詳細については、IF実験の最適に関する技術的なヒントをご覧ください。

図3.グルカゴン抗体とインスリン抗体を用いた4% PFA固定ヒト膵臓組織の免疫蛍光分析。  緑:  グルカゴン(15954-1-AP赤:  インスリン(66198-1-Ig)

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Posted:
7 August, 2019

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