複数ラベルを使用した免疫染色のための5つのヒント

多重免疫染色法は、同じサンプル中の2つ以上の異なる抗原の発現および共局在を研究するために、個々の抗原検出を組み合わせたものです。


なぜ、複数の抗原染色を用いた実験を行うのか(図1)?

- 単一の組織または細胞サンプルにおける複数の抗原局在について直接的に概観するため。

- サンプル内の異なる細胞集団を識別するため(時間スケール実験)。

- 共局在を調べるため。例えば、Tリンパ球の活性状態を推測するために、細胞マーカーや活性化マーカーを染色することができる。

- 希少な組織切片や細胞サンプルを節約するため。

図1.1:50に希釈した66200-1-Ig(アセチル化チューブン(Lys40)抗体)と、Alexa Fluor 488標識AffiniPure ヤギ 抗ウサギIgG(H+L)を用いたMDCK細胞の免疫蛍光分析。


多重染色を成功させるためには、実験を実行する前に以下のヒントを参考にすることをお勧めします。

ヒント1:顕微鏡の設定

特に、顕微鏡の発光/励起/ダイクロイックフィルターの設定、そして共焦点顕微鏡の場合はレーザーラインの設定など、使用する顕微鏡に精通しておくことが不可欠です。

- 蛍光体/顕微鏡の適合性について、スペクトルビューアーや蛍光体リファレンスチャートを確認して設定しましょう。これにより、蛍光体標識抗体の最大励起波長および最大発光波長を確立することができます。

特定のフィルター、例えばFITC/TRITCフィルターの場合、一緒に使用されると想定される蛍光体にちなんでその名前が付けられているので、適合性の評価は極めて簡単です。例として、Alexa Fluor® 488は、およその励起最大波長(nm)に基づき命名されており、レーザーおよびフィルターの選択のための簡単なガイダンスも示されています。

ヒント2:正しい蛍光体を選択する;個々の検出チャンネル間の交差反応を避ける方法

1.吸光係数(ε)の高い蛍光体を選択する

蛍光体の明るさに影響を与える最も重要な要因の一つが吸光係数であり、吸光係数の値が大きいほど蛍光体の明るさは明るくなります。

2.量子収率(Φ)の高い蛍光体を選択する

量子収率は、蛍光処理の効率(Φ)を測定するもので、放出された光子の数を吸収された光子の数で割ったものです。一般的に、蛍光処理の効率が100%の場合、量子収率は1(量子収率の可能最大値)となります。

3.光退色感受性の高い蛍光体は使わない

光退色とは、蛍光シグナルの強度を低下させる光化学的な変性プロセスです。

注記:励起光の強度/曝射時間を短くしたり、退色防止試薬を含む封入剤を使用したりすることができます。

4.蛍光体の染色が対比染色とスペクトル的に異なっていることを確認する

注記: 対比染色は、バックグランドとの対比を提供し、観察される染色を視覚化するのに役立ちます(例えば、DAPIは核を染色します)。

注記:対比染色や蛍光体染色では、見分けやすいように設定することを忘れないでください。例えば、Alexa Fluor 405またはDyLight Fluor 405(図2)のような青色蛍光体にコンジュゲートされた抗体を使用する場合、核対比染色では、DAPIよりもDraq5がより良好に機能します。

図2.4% PFA固定した対照hiPSC由来の神経細胞培養物(35日培養)の、MAP2抗体(17490-1-AP、1:250希釈)およびTUBB3抗体(66375-1-lg、1:250)を用いた免疫蛍光染色。(赤:MAP2;緑:TUBB3;青:DAPI)。ハンガリーのBioTalentum社より提供。

5.多重色素IF実験では、スペクトルの重複を避けるため、発光スペクトルの狭い蛍光体を使用する

スペクトルの重複は、ブリードスルー(滲み)として知られており、別の蛍光体のフィルターセットの中で見られる、ある蛍光体の検出と説明されます。ブリードスルーがあると、明瞭な蛍光信号の観測が困難になり、共局在性の実験の評価を混乱させてしまいます。

注記:蛍光体を選択する一方で、スペクトルビューアーを使って発光・励起のスペクトルが重なっていないかを確認します。

‐ 標的タンパク質の発現量に基づいて、別々のチャンネルで検出可能な最適な蛍光体を選択します。

‐ 関心のあるタンパク質の発現量/発現パターンをもとに、多重色素実験において、どの蛍光体を使ってどの抗原を検出するかを決定します。最も明るい蛍光体は、最も発現量の少ない抗原の検出のためにとっておくべきです。最も発現量の多い抗原を検出する際は、最も暗い蛍光体を使用するべきです。

ヒント3:最適な多重色素染色法を選ぶ

オプション1:非標識抗体と連続インキュベーション

このオプションは、一次抗体が異なる宿主に由来し(例えば、抗原Aに対してマウスモノクローナル抗体、抗原Bに対してウサギポリクローナル抗体、抗原Cに対してヤギポリクローナル抗体を使用)、それらの抗体が同時インキュベーション法で凝集体形成を呈する場合に有用です。

オプション2:非標識一次抗体と同時インキュベーション

このオプションは、一次抗体が異なる宿主に由来(例えば、抗原Aに対してマウスモノクローナル抗体、抗原Bに対してウサギポリクローナル抗体を使用)する場合に有用です。

注記:ブロッキングバッファーは、二次抗体の各宿主の血清を混合して調製することができます。

オプション3:直接標識された一次抗体と同時インキュベーション

このオプションは、一次抗体が同じ宿主に由来(例えば、抗原Aに対してマウスモノクローナル抗体、抗原Bに対してマウスモノクローナル抗体を使用)する場合に有用です。

細胞のランドマークを識別するため、対比染色を活用する

対比染色は、次の2つの異なる目的で使用されます:

- バックグランド蛍光を減らすため

- 細胞小器官を特定し、シグナルの局在に関する情報を提供するため

核対比染色の推奨インキュベーション:0.1~1μg/mLの核染色色素を用い、徹底した追加のPBS洗浄を行った、室温下5分間のインキュベーション(図3)。

図3.E15マウス皮質ニューロンの抗ATG5抗体(10181-2-AP;1:50)によるIF結果。NF1抗体で細胞を共染色した(緑色)(40倍レンズ下)。細胞を4% PFAで固定し、0.2% Triton X-100で透過処理させた。

封入溶剤の中には、DAPIがすでに添加されているものがあり、空気に触れると硬化するため、カバースリップのエッジをシールする必要がありません。

注記:細胞の入ったカバースリップを誤って落としてしまい、サンプル側が上になって方向が分からなくなってしまった場合でも、慎重にピンセットでカバースリップを拾うことで実験を継続することができます。その場合は、ピペットチップでカバースリップの片面を軽くこすって、細胞が取れるかどうか目視で確認することで、カバースリップの向きを決定し、サンプルをマウントします。

ヒント4:抗体/抗体のペアを選択する前に考慮すべきこと

ポリクローナル抗体は、免疫グロブリンGの複数のアイソタイプ(例えば、IgG1、IgG2a)の混合物を含みます。したがって、標的の検出を最大化するためには、すべてのアイソタイプを認識する二次抗体を使用することが最も良いといえます。このような抗体は、「IgG H+L」(HおよびLは、それぞれIgGの重鎖および軽鎖を表します)と標識された任意の二次抗体です。これによって、二次宿主種は他の種からのIgGプールで免疫化されることになり、精製された二次抗体がすべての形態を認識できるようになります。

モノクローナル抗体は、免疫グロブリンの単一のアイソタイプを含みます。したがって、そのアイソタイプを特異的に認識する二次抗体を使用することが重要です。一次抗体のアイソタイプは、製品データシートに記載されているはずです。

最良の方法は、それぞれの一次抗体が異なる種から生成されていることを確実にすることです。これは、用いられる蛍光標識二次抗体が、その後の個別のチャンネルで検出されるようにするためです。

ヒント5:適切な対照を用いる

観察される蛍光が非特異的アーチファクトではなく染色の結果であることを検証するために、少なくとも4つの対照を含めます。

1. 非染色のサンプル(自家蛍光バックグラウンドシグナルを決定するため)。

2. 二次抗体のみで染色したスライド(バックグラウンドシグナルのしきい値を決定するため)。

3. 組織/細胞型の対照。組織/細胞を有するスライドでは、関心のあるエピトープを発現する(または発現しない)ことがわかっています。

4. それぞれの染色を別々に行う(交差反応を起こさず、適切な標識ができるようにするため)。

注記: 画像は、サンプル全体にわたってよく見られ、代表的なパターンを間違いなく表していることを確認してください。

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Posted:
8 March, 2018

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