ヒントとコツ | 免疫蛍光 (IF) 染色実験をするための9つのこと

免疫蛍光 (IF) 染色実験でより良い結果を得るために、9つのポイントを解説します。


概要

免疫蛍光染色(IF)入門

ヒント:

1. サンプルに適切な固定液を使用してください。

2. 標的の染色に適切な界面活性剤を選択してください 。

3. 適切なコントロールを使用してください。

4. 希釈および細胞密度を最適化してください。

5. 一次抗体とは異なる生物由来の血清をブロッキングに使用してください。

6. 一次抗体および二次抗体の最適化

7.  複数染色のステップ (オプション)

8. 細胞構造の特定を容易にするため、対比染色を使用してください

9. サンプルのマウンティングを適切に行ってください

 

免疫蛍光染色(IF)入門

免疫蛍光染色(IF)は、細胞または組織の状態で、細胞タンパク質およびその他の抗原を抗体によって検出し、局在を確認することを可能にする手法です。

IFは、十分に確立された手法である一方、実験を開始する前にいくつかの検討すべき事項があることを本稿では提案します。

 IFのヒント1: サンプルに適切な固定液を使用してください。

固定液には、アルデヒドと有機溶媒の2つの一般的なクラスがあります。

アルデヒド(ホルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド)は、膜結合性抗原および細胞骨格抗原の二重標識に適しています。核およびミトコンドリアタンパク質に推奨されます。

推奨される固定ステップ:

2%~4%パラホルムアルデヒド(PFA)を用いて、室温で10~20分間のインキュベーション(図1)。

以下の点に注意してください:

この方法は、タンパク質を化学的に修飾し、抗原性を破壊することがあります。

アルデヒドを使用した固定には、アミンおよびタンパク質とのアルデヒド反応によって生じる自己蛍光を低減するため、「クエンチング」ステップが必要になる場合があります。

組織は、細胞培養よりも長いアルデヒド固定処理を必要とします。

有機溶媒(メタノール、エタノール、またはアセトン)は、脱水およびタンパク質沈殿によって作用します。有機溶媒系は、内部タンパク質構造内の1つのエピトープにのみ結合するモノクローナル抗体を使用する場合に推奨されます。

メタノールは、凍結サンプルに最適です。メタノールは細胞構造を保存し、タンパク質の二次構造を安定化します。しかし、水溶性成分と脂質成分が失われる可能性があります。

アセトンは強力な脱水剤です。さらに、アセトンは、組織タンパク質を不可逆的に沈殿させることができます。組織学的保存には、アセトンはメタノールよりも優れています。アセトンを使用する場合、透過処理ステップを追加する必要はありません。

図1. HepG2細胞を使用したパキシリン抗体染色(カタログ番号:10029-1-Ig、1:50、緑色)。細胞を4%PFAで固定し、0.2%Triton X-100で透過処理し、チューブリン(カタログ番号:66031-1-Ig; 1:100;赤色)を用いて共染色、40 x顕微鏡下で観察。


IFのヒント2: 標的の染色に適切な界面活性剤を選択してください 。

- アルデヒド固定を行った場合は、抗体が細胞内に届くように、細胞を透過処理する必要があります。

- 有機溶媒ベースの固定は、このステップを必要としません。

抗体は、アルデヒド固定後に透過処理されていない場合、細胞膜を通過できません。細胞内標的にアクセスするには、ジギトニン、ロイコパーム、サポニンなどの穏やかな試薬が必要です。内膜(核、ミトコンドリア等)の染色を可能にするには、Triton X-100やNP-40など、より強力な非イオン性界面活性剤が推奨されます(図2)。

推奨される透過処理ステップ:

- 細胞質標的 – 0.5〜1 mg / mLの穏やかな界面活性剤(DMSO中にストックとして調製)を用いて10~30分間室温でインキュベーション

- 内膜内の標的– PBS中0.1%~0.2% Triton X-100を用いて、10 分間室温でインキュベーション

図2. 透過処理していない細胞と、穏やかな界面活性剤(ジギトニン)および強力な非イオン性界面活性剤(Triton X-100)により透過処理した細胞を用いた場合の抗体のアクセス可能性。

以下の点に注意してください:

SDSは、固定細胞のわずかな変性を誘発して、マスクされている可能性のあるエピトープを曝露するのに有用な透過処理剤です。SDSは、小さく、架橋が不十分なタンパク質を抽出することができます。しかし、沈殿によって固定されたサンプルには使用しないでください(例:メタノールによる沈殿)。

IFのヒント3: 適切なコントロールを使用してください。

適切な陰性コントロールを使用して、染色の特異性を検証してください。

適切な陰性コントロールの例には、以下のものがあります:

- 二次抗体によってのみ染色されたスライド (バックグラウンドシグナルの閾値を決定するため)

- 分析対象の抗原を欠く細胞で作製したスライド

 IFのヒント4: 希釈および細胞密度を最適化してください。

染色時に約50%コンフルエンスになる細胞数を選択します。

染色時に約50%コンフルエンスになる細胞数を選択します。

- 細胞密度が高すぎる場合は、細胞構造が変形し、低倍率でバックグラウンドが高くなる可能性があります。

- 細胞密度が低すぎる場合は、最適な細胞パターンを観察できるフィールドを見つけるのが困難になります。

特別なコーティングが必要となる場合

- 非接着性細胞および低接着の細胞は、ガラス表面上で増殖させることが困難です。この場合、カバーガラスをポリリジンまたは細胞外マトリックス(例、コラーゲンまたはラミニン)でコートします

- 組織(例、血管や脳サンプル)によっては、複数回の洗浄ステップ後にスライドへの接着を維持するために、ゼラチンコートスライドまたはポリリジンコートスライドが必要な場合があります。

下記の点に注意してください:

特異的染色を達成するには、1μg/mLの精製抗体または1:100〜1:1000希釈の抗血清で十分です。抗体価測定実験を行って、抗体希釈を最適化することを推奨します。

IFのヒント5: 一次抗体とは異なる生物由来の血清をブロッキングに使用してください。

ブロッキングバッファーとして、(1%~5%)ウシ血清アルブミン(BSA)、乳粉末、または血清のいずれかを用いて、室温で1時間インキュベートすることを推奨します。

下記の点に注意してください:

これらのブロッキングタンパク質は、一次抗体を産生させた種に由来しないことが重要です。そうでないと、一次抗体に対する二次抗体の特異性が失われます。

例えば、お客様の二次抗体が、マウスの一次抗体に対してヤギで産生された場合は、ヤギ正常血清が適しています。

 IFのヒント6: 一次抗体および二次抗体の最適化

通常、一次抗体のインキュベーション時間は、室温で1〜2時間、または暗所4°Cでオーバーナイト(ON)です。

どちらの抗体(一次および二次)も、ブロッキングバッファーで希釈する必要があります。

- 直接IFでは、一次抗体はすでに蛍光色素を持っているため、サンプルのマウントに直接移行することができます。

- 間接IFでは、標識された二次抗体を一次抗体に結合させる追加のステップが必要です。

以下の点に注意してください:

ここで重要な点は、一次抗体とのインキュベーション後に徹底的な洗浄を行って、二次抗体による非特異的結合を減らすことです。

IFのヒント7: 複数染色のステップ (オプション)

- それぞれの一次抗体は、異なる種由来のものである必要があります。これにより、別々のチャンネルによって検出されるフルオロフォアと結合させた二次抗体を使用することが可能になります。

- あるいは、サンプルを順次二重染色することもできます。その場合、まず1つの抗原に対してブロッキング、一次、および二次インキュベーションをすべて完了してから、次に2番目の抗原に対してこれらを実施します。

IFのヒント8:細胞構造の特定を容易にするため、対比染色を使用してください

対比染色は、2つの異なる目的に使用されます:

- バックグラウンド蛍光を低減するため

- 細胞小器官を識別し、シグナルの局在に関する情報を提供するため。

最も一般的な核対比染色用染料は、DAPI(ジアミジノ-2-フェニルインドール)、Hoechst 33342、ヨウ化プロピジウム(PI)、およびFar RedDraq5です。  

核の対比染色に推奨されるインキュベーション:

0.1〜1μg/mLの核染色用染料と室温5分間のインキュベーション、およびその後の徹底的なPBS洗浄(図3)。

図3. E15マウス皮質ニューロンを使用した抗ATG5抗体(カタログ番号:10181-2-AP、1:50)のIF結果。細胞をNF1抗体(緑色)により共染色し、40倍顕微鏡下で観察。細胞を4%PFAで固定し、0.2%Triton X-100を用いて透過処理した。

IFのヒント9:サンプルのマウンティングを適切に行ってください

カバーガラス/組織サンプルを一滴の封入剤を用いてマウントします。次に、サンプルをマニキュア液で密封し、顕微鏡下での乾燥や動きを防ぎます(図4)。顕微鏡分析後、-20°Cまたは+ 4°Cの暗所に保管します。

図4. HepG2細胞を用いたLC3B特異的抗体染色(カタログ番号:18725-1-AP; 1:50;緑色)。細胞を4%PFAで固定、0.2%Triton X-100で透過処理、チューブリン(カタログ番号:66031-1-Ig; 1:100;赤色)を用いて共染色し、40 x顕微鏡下で観察。
Blog

Posted:
22 March, 2017

Share:


Back
to top