ゲスト寄稿 | 細胞成分を分画するための8つのこと

オルガネラを抽出、分画する時に考慮すべき8つのことについて解説します。

Alex Ryan著

細胞成分分画とは、細胞を様々なオルガネラに分離する方法です。高濃度のショ糖は、その密度に基づいて細胞画分を分離するために使用されます。単離された1種類のオルガネラを調べるのに有用で、細胞のない環境で、干渉を受けずにプロセスを研究することができます。

細胞成分分画を成功させるための私のヒントをここにご紹介します

1. 自分のタンパク質を知る

まず第一に、そして最も重要なことは、自分のタンパク質を知ることです。このフレーズは何度も出てきますが、繰り返しますので忘れても心配しないでください。この知識が最初に役に立つことの一つは、そもそも分画処理が必要かどうかを見極めるということです。分画を行う理由はたくさんあります。タンパク質輸送、膜動員と隔離を調べたい場合もありますし、上記のように、他の細胞機能の干渉なく、単一のプロセスを調査したい場合もあります。タンパク質を単離して調べたいだけなら、代わりに免疫沈降法のような方法を検討してください。

最初から、分画実験を計画する際に自身のタンパク質について最初に知っておくべきことは、そのタンパク質がどこにあると予想されるかということです。分画にはさまざまなタイプがあり(後ほど説明します)、どのタイプを選択するかは、目的のタンパク質がどこにあるか、そして得られたタンパク質で何をしたいかによって異なります。また、タンパク質の機能も方法の選択に影響する可能性があるため、そのタンパク質の特性も知る必要があります。膜貫通型タンパク質は、精製に関しては、言うなれば非常に気難しいものです。私は個人的な経験から、インスリン応答性グルコーストランスポーターGLUT4が非常に厄介なタンパク質であることを知っています。

2. 方法を賢く選ぶ

これは、自分のタンパク質を知ることから来ています(上記参照)。分画の方法にはいくつかあり、方法によって得られる画分数が違います。これは、タンパク質を知っているかどうか、そしてそのタンパク質を使って何をしたいかにかかっています...かなり単純な細胞成分分画法では、粗膜画分しか得られないことがあります[1]。この方法を使用すると、3つの画分が得られます:核画分、単一の膜画分、非常に希薄な細胞質画分です。細胞を低張緩衝液で膨潤させると、核が分離されます。上清を比較的低濃度のスクロース(0.34M)中で回転すると、膜ペレットと細胞質上清が得られます。

Waliら[1]が報告しているように、ホモジナイゼーション緩衝液からTriton X-100を除去することは、膜でのタンパク質の活性を見る場合、特にそれらのタンパク質が活性化時に膜に動員される場合(例えば、ホスホリパーゼC)には理想的な方法です。それ以外にも、この方法はウエスタンブロット分析のための完璧なサンプルを提供します。細胞質画分をさらに遠心分離することで、個々のオルガネラを得ることができます[2]。

より詳細な分画は、より高濃度のスクロース(1.2M)を使用して、いくつかの別々の遠心分離を使用することで達成することができます[3]。この場合、画分を高密度の脂質画分(すなわち粗面小胞体)と低密度の脂質画分(すなわち滑面小胞体、ゴルジ体、小胞)に分けることができます。遠心分離の長さに応じて、個々のオルガネラを単離することが可能です[4]。これらの画分は、細胞全体のトラフィッキングを調べる場合、ウエスタンブロッティングに最適です。

3. 溶解バッファーと膨潤バッファー

上記でお気づきかもしれませんが、低張膨潤バッファーは、細胞膜の細胞成分分画の鍵です。溶解バッファーには、一般的にSDSなどの洗剤や、細胞を分解するための酸が含まれています。洗剤は膜中の脂質を破壊し、膜を実質的に消滅させます。一方、膨潤バッファーは、浸透圧によって細胞を穏やかに 「破裂」させる高張溶液です。膜の完全性が重要な実験の場合は、絶対に溶解バッファーを使用すべきではありません。

4. タンパク質の活性に注目していますか?

タンパク質の活性を研究する場合には、この考察が重要です。そのような場合、タンパク質の活性が全く損なわれていないことが不可欠です。多くの緩衝液には、ホスファターゼ阻害剤、EDTAまたはEGTA、および洗剤が含まれていますが、これらはすべてタンパク質が適切に機能するのを妨げることがあります。ウエスタンブロットを使用して画分を分析する場合は、タンパク質が機能せず変性していても問題ありませんが、細胞のプロセスを生化学的に調べる場合は、すべてのタンパク質が正確に機能できることが不可欠です...そのため、添加物は入れないでください。

5. 画分を知る

個々の画分、またはオルガネラのウエスタンブロットを行う場合は、正しいオルガネラ画分を見ていることを確認することが重要です。幸いなことに、Proteintech社のような抗体会社は、オルガネラや画分に特異的なコントロール抗体(下記参照)を多数保有しており、これらを使用して目的の単離された細胞成分が正しいものであることを確認することができます。確認が困難な画分もあります(細胞膜画分など)。そのような場合は、純度を評価するために陽性マーカーと陰性マーカーの両方のパネルを使用することを検討してください。

抗体はウエスタンブロットによる画分の検証に有用です。この画像は、Proteintech社の抗体の一部を用いた免疫蛍光イメージングにより可視化された様々なオルガネラを示します。これらは、ウエスタンブロット膜上の画分ローディングプローブとしての使用にも適しています。L-R Hela細胞は抗αチューブリン(赤色)で染色し、A431細胞のERは抗カルネキシン(緑色)で染色し、抗ラミンA/C(左から3番目)と抗ラミンB1(右端)はHepG2細胞サンプルの核エンベロープ(赤色)を染色します。

6. Igepal CA-630はあなたの味方!

Igepal CA-630は、膜貫通タンパク質を分解から保護することができます。ウエスタンブロットで膜貫通タンパク質が見えにくい場合は、0.1% (v/v) Igepal CA-630を添加するとよいかもしれません。

 7. 前もって計画を立てる

細胞成分分画には時間がかかります...。上に挙げたGLUT4の例では、実験は実際に3人がかりの作業になってしまいました。私の上司は、彼女が朝7時半頃に到着した時に検体を刺激します。私は8時半に出社して、分画、タンパク質アッセイを行い、ウエスタンブロッティング用のサンプルを準備していました。それから私は午後5時頃、別の博士課程の学生に、60℃で30分間のサンプルの「煮沸」を任せます。その後、彼はすぐにゲル電気泳動を実行し、転写します。つまり、実験全体では約14時間かかるということです。なお、ここにはその後のウエスタンブロッティングによる分析は含まれていません。

また、すべての画分を可能な限り氷上に置き、すべての緩衝液を氷冷することも重要です。さらに、超遠心分離機は冷却に時間がかかることがあるので、早めに開始することが重要です。目覚まし時計を再認識して、同僚と仲良くしましょう!

8. 自分のタンパク質を知る

うん、繰り返すと言ったでしょう...重要なことなのです。

関連抗体

オルガネラ
カタログナンバー ターゲット
Cytoskeleton 66031-1-AP α tubulin
Cytoskeleton HRP-66031 (HRP-conjugated) α tubulin
Cytoskeleton 60008-1-Ig/20536-1-AP β actin
Cytoskeleton HRP-60008 (HRP-conjugated) β actin
Endoplasmic reticulum 10427-2-AP Calnexin
Endoplasmic reticulum 11587-1-AP GRP78/HSP70
Golgi 11308-1-AP GM130
Golgi 12255-1-AP/66170-1-Ig RCAS1/EBAG9
Membranes 20648-1-AP E-Cadherin
Membranes 14418-1-AP Na+/K+ ATPase
Membranes 17435-1-AP/66171-1-Ig Transferin
Mitochondrion 11242-1-AP COX IV 1
Mitochondrion 10866-1-AP VDAC1/Porin
Nuclear envelope 10298-1-AP lamin A/C
Nuclear envelope 12987-1-AP Lamin B1
Nucleus 20813-1-AP LSD1/KDM1
Nucleus 11231-1-AP SETDB1/ESET

 

参考文献

 

1. Wali, R. K., Baum, C. L., Sitrin, M. D. and Brasitus, T. A. (1990) 1,25(OH)2 vitamin D3 stimulates membrane phosphoinositide turnover, activates protein kinase C, and increases cytosolic calcium in rat colonic epithelium. J. Clin. Invest. 85, 1296–303.

 

2. Schröter, C. J., Braun, M., Englert, J., Beck, H., Schmid, H. and Kalbacher, H. (1999) A rapid method to separate endosomes from lysosomal contents using differential centrifugation and hypotonic lysis of lysosomes. J. Immunol. Methods 227, 161–168.

 

3. Grainger, D. L., Tavelis, C., Ryan, A. J. and Hinchliffe, K. A. (2011) Involvement of phosphatidylinositol 5-phosphate in insulin-stimulated glucose uptake in the L6 myotube model of skeletal muscle. Pflugers Arch. 462, 723–32.

 

4. Graham, J. M. (2001) Isolation of Golgi membranes from tissues and cells by differential and density gradient centrifugation. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3.9.

 

Blog

Posted:
7 October, 2015

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