ヒントとコツ | IP実験をするための8つのこと

IP (免疫沈降) 実験でより良い結果を得るために、8つのポイントを解説します。


はじめに

免疫沈降(IP)は、多数の他のタンパク質を含む無秩序とも言える混合物溶液からタンパク質を分離する、十分に確立された手法です。組織ホモジネートから細胞ライセート(溶解物)まで様々な溶液が対象になりますがゴールは同じです。すなわち、特定のタンパク質を1つだけ分離することによって、目的のタンパク質以外には何も分離されないか、共免疫沈降の場合等では少なくとも非常に少量な状況を得ることができます。タンパク質IP手順を基にした、クロマチン(ChIP法)やRNA(RIP法)を分離するためのプロトコルもありますが、本稿では、タンパク質バージョンにのみ焦点を当て、より優れたIP実験を実施するためのヒントを提供します。

1.ライセートの調製

英語には古い格言があります:「You only get out what you put in(あなたが入れたものだけを、あなたは受け取るのだ。)」。このことわざはIP実験にも当てはまります。まずは、十分な量の材料から始めましょう。すなわち、開始サンプル量0.2〜0.5 mlごとに1〜3mgの総タンパク質を目指します。また、細胞または組織溶解におけるサンプルの破壊/損失を防ぎ、手順全体を通して、標的タンパク質を可能な限り良好な状態に保つことも目指す必要があります。これは本当にバランスの取れた行為です。理想的な溶解バッファーは、タンパク質を本来のコンホメーションに保ち、抗体結合部位の変性を最小限に抑えるだけでなく、捕捉・分析するのに十分なタンパク質を遊離させます。当社ラボでは通常、RIPAバッファーを使用します。これにより、タンパク質の分解と、タンパク質の免疫反応性や生物活性への影響を回避しながら、効率的な細胞溶解とタンパク質の可溶化が可能になります。RIPAバッファーを使用すると、経験的にIPのバックグラウンドが低くなります。なお、核抽出物の核膜破壊に特に有用ですが、キナーゼを変性させることがあるため、キナーゼ活性試験がゴールの場合は注意してください。また、プロテアーゼ阻害剤(およびリン酸化を調べている場合はホスファターゼ阻害剤)を添加することを忘れないでください。

RIPAバッファーのレシピは、こちらです。RIPAバッファーの代替品をお探しの場合は、可能であれば塩と界面活性剤を控えめに使用することをアドバイスします。十分な試行を重ねたバッファーを優先し(科学フォーラム(Protocol Online)でレシピを見つけることができます)、バッファーレシピを少し調整する必要がある場合は、HarlowとLane、231ページで推奨されている以下の範囲内に留めます(下のボックスを参照)。

2. 最適な抗体の選択

一般的に、標的タンパク質の捕捉には、可能であればポリクローナル抗体の使用を検討すべきです。図1では、その理由を視覚的に説明しています。一般的にお客様は、IP手順の開始時に抗原-抗体免疫複合体を確立することを目的としています。ポリクローナルは標的タンパク質上の複数のエピトープに結合するため、より多くの標的タンパク質を保持します。ゴールは不要なタンパク質や成分を後で洗い流すことなので、サンプルも一緒に洗い流されないように、かなり高い保持率が必要です。したがって、質の良いポリクローナルがあれば、IP手順用抗体の第一候補として優先されるべきです。

図1: 捕捉抗体としてのポリクローナル抗体vsモノクローナル抗体。ポリクローナル抗体は、より高い保持率で、より強固で密接な免疫複合体を形成します。

当社の幅広いポリクローナル製品群は、上記の内容に適合し、ネイティブ(天然)かつインタクト(無傷)なエピトープの認識にも優れているため、IPに最適です。ネイティブのエピトープは依然として3次元コンホメーションを保持し、また当社抗体は全長タンパク質に対して生成されているため、IPサンプル内のインタクトなタンパク質全体を良好に認識します。(一方、ウエスタンブロッティング(WB)段階での検出にはモノクローナル抗体の使用を推奨しますが、そのことについては後述します。)

3. プレクリアステップを実施すべきか、実施しないべきか

プレクリア(事前の澄明化)は、IP実験に使用する固相担体に結合させたくない非特異的なタンパク質、脂質、炭水化物、または核酸を除去するステップです。このステップは、捕捉抗体の非存在下で、固相担体(例えば、アガロースビーズ)とライセートとをインキュベートすることによって行われます。プレクリアに使用された固相担体と、これに結合しているものはすべて廃棄します。このステップは、固相担体のタイプによって異なります。また、検出抗体がどの程度優れているか、および目的のタンパク質がどれくらいの量ライセートに含まれているかにもよります。一部の固相担体は特定のタンパク質に非特異的に結合する可能性が高いため、最初にメーカーの推奨事項を確認します。プレクリアステップは、全て省略できる場合もあります。

捕捉抗体と同じアイソタイプの非特異的抗体を添加するプレクリアス法もあります。これにより、沈殿中に捕捉抗体にも非特異的に結合する可能性のあるものを全て除去することができます。

一般的に、当社ラボでは、IP検証を実施する際にライセートをプレクリアすることはありません。その理由は、定期的に多数のIP試験を実施している場合、プレクリア手順を常に含めることが難しいためです(上記の検出抗体の質に関する部分も参照してください)。プレクリアは必ずしも必要なわけではありません。また、不必要なサンプルの損失を防ぐためにも、プレクリア試薬の必要量を注意深く評価する必要があります。

4. 洗浄と溶出 – どのように進めるかに注意!

遠心分離がIP実験の結果に及ぼす影響は、多くの場合過小評価されています。免疫複合体を遠心分離する際に、その速度が高すぎると、免疫複合体中の抗体-抗原相互作用が破壊され、溶出前のサンプル損失の原因となります。そのため、洗浄および溶出のステップから遠心分離を完全に省略することを推奨します。代わりに、マイクロ遠心チューブに入れたフィルターカラムを使用して、重力流で洗浄を実施し、溶出物を取得します。

5. 溶出サンプルと煮沸サンプルの比較

従来の信号対ノイズ比(SN比)の改善手段は、IPの最終段階における免疫複合体の分離の効率性を損なう程、標的タンパク質を可能な限り大量に保持することを目的としていました。通常この目的のためにとられるステップとして、還元剤を含まない溶出バッファーの使用、またはSDS-PAGE前の煮沸ステップの省略があります。溶出を完全に省略し、固相に付着したままのサンプルを洗浄段階後に煮沸する場合もあります(図2Aを参照)。その結果、WBでの標的シグナルは改善されますが、固相の存在により非特異的染色が大幅に増えます(図2を参照)。当社は、これを行わずに、ゲルにロードする前にまず固相担体からサンプルを溶出させることを強く推奨します。

図2:洗浄直後に(固相担体に付着したまま)煮沸したサンプル(A)と、pH2のバッファー(150 mMグリシン、500 mM NaCl)を用いて溶出し、SDS-PAGEゲルにローディングする前に中和した後に煮沸したサンプル(B)の比較を示します。捕捉および検出抗体は抗NFKBIA(カタログ番号:10268-1-P)を用いています。検出は、HRP結合プロテインAを使用して行いました(代替検出方法のセクションを参照)。細胞溶解物(ライセート):HeLa。

6. 画分を保存しましょう!

免疫沈降の最初の試行が失敗した場合は、すべてのIP画分(プレクリアを実施した場合はそれも含む)を保存しておいて、後でSDS-PAGEによって分析することを推奨します。

7. 抗体ペア

抗体ペア、つまり、一つの種由来の捕捉抗体と、それとは別の種から得たWB検出用抗体とを使用することも、IP実験を計画する際に考慮すべき要素です。抗体選択プロセスは、2つの抗体が異なる種に由来することに加え、標的タンパク質の異なるエピトープを認識することを確認してください。抗体の種類(すなわちポリクローナルか、モノクローナルか)も重要です。可能な場合は、ポリクローナル捕捉抗体と検出用モノクローナル抗体の組み合わせを推奨します。これにより、高い検出特異性と最大の捕捉効率が確実になります。図3の例を参照してください。

図3:ポリクローナル捕捉抗体(カタログ番号:10782-2-AP)とモノクローナル検出抗体(カタログ番号:60019-1-Ig)を使った場合(A)と、捕捉と検出の両方に同じ抗体(カタログ番号:10782-2-AP)を使用した場合(B)の比較。検出は、HRP-ヤギ抗マウス(A)およびHRP-ヤギ抗ウサギ(B)を使用して実施されました。使用した細胞溶解物(ライセート)は、K-562全細胞ライセート。

8. 代替検出方法の試行!

これまでにIP実験を行ったことがある人なら誰でも、捕捉抗体の重鎖(HC)と軽鎖(LC)が標的シグナルに影響する場合があることをご存知でしょう。これは、捕捉と検出に同じ抗体を使用し、その後に種特異的抗体を使用して二次検出を行わざるを得なかった場合の避けられない技術的影響産物(アーチファクト)です。IPとWBに同じ種の抗体を使用することを本当に避けられない場合でも、心配しないでください。ターゲットタンパク質を検出する別の方法については、BioTechniques 3月号に掲載されているアプリケーションフォーラム記事をお読みください。IP手順全体で1つの抗体を使用しても 、HCまたはLCバンドからのシグナル干渉を回避できます 。

 

参考文献

Harlow, Ed, and David Lane. Using Antibodies. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
Bonifacino, Juan S. et al. Current Protocols in Immunology 8.3.1-8.3.28, New York: John Wiley, 2001.

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Posted:
17 August, 2016

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