ヒントとコツ | ウェスタンブロット実験7つのこと

ウェスタンブロット実験の条件検討で考慮すべき7つのポイントを解説します。

Deborah Grainger著

ウエスタンブロッティングは、精密な科学ではありません。すぐに出版できるような完璧な結果をすぐに出すことが、ノルマとは限りません。しかし、ブロッティング実験を洗練させ、可能な限り、最高のスタートを確実に切るための手順があります。この微調整プロセスは、「最適化」と言われ、ウエスタンブロッティングプロトコルのいくつかの段階において適用できます。

 

1. SDS-PAGE

ウエスタンブロッティング実験は、メンブレンでの作業を開始するずっと前から始まっています。サンプル調整にまで遡ることはできますが、スペースの都合上、サンプルの分離から始めることにしましょう。これについては、手を入れたものがそのまま結果として出てきます。つまり、良好なSDS-PAGEゲルがないと、良好なメンブレンを得ることはありませんし、そこからすべてが明らかになっていくのです。自分でゲルをキャストする場合は、構成に均一性を持たせるよう細心の注意を払いましょう。適切なアクリルアミドの割合を選択します(プロテインテック社のウエスタンブロットプロトコル[PDF]を参照)。高電圧でゲルを操作したり、空のウェルを1xサンプルバッファーと同等の量で満たしたりする誘惑に抵抗することで、色素面の「スマイリング」作用を回避します。

何よりまず、均一な量のタンパク質を負荷します。アッセイでタンパク質濃度を決定し、「ストリーク状」のブロットが得られたら負荷量を減らすように調整します。プロテインテック社のバリデーションラボでは、1レーンあたり30μgのタンパク質を使用することで、通常はストリークのない、分離の良いバンドが得られることを確認しています。

2. メンブレン

メンブレンの選択により、ウェスタンブロッティング実験の結果に大きな違いが生まれることがあります。主なメンブレンの種類はPVDFとニトロセルロースの2種類ですが、現在、消耗品市場には、蛍光ベースの免疫検出や低分子タンパク質に最適化されたメンブレンなど、それぞれについてバージョンがいくつか存在しています。

PVDFは、ほとんどの酸およびアルカリに対する靭性、安定性および抵抗性に関して評価されています(つまり、ブロットをストリッピングし、リプロービングしたい場合に適したメンブレンであることを意味します)。PVDFメンブレンはまた、ニトロセルロースよりも優れたタンパク質保持の特性を持っています。

ニトロセルロースメンブレンは、容易にブロッキングされ、一般に、高い信号対雑音比を示します。しかし、それらをストリッピングしリプロービングすることはできませんし、ニトロセルロースメンブレンの細孔サイズにも注意してください。

最後に、ラボの伝統について一言。ラボの標準だからといって、メンブレンの種類を変えることを恐れてはいけません。何か違うことを試してみることが、最適なウエスタンブロットの秘訣かもしれません。

3. 抗体濃度

抗体の選択に必要な労力を費やしたと仮定して、次のステップは、最適な作用抗体の濃度を決定することです。

抗体と抗原の結合速度(アフィニティ定数)は、溶液中の相対濃度(そのほか、温度やpHなどの他の変数)に影響されます。抗原量は通常、ウェスタンブロッティングでは固定されています(すなわち、タンパク質はメンブレンに固定されています)ので、より良いブロットを得るためには、大抵、抗体濃度を調整する必要があります。このような組織だった方法で、つまり、他のすべてのパラメータを一定に保ちながら抗体を複数回希釈してテストすることで、実験に最適な抗体の濃度を決定することができます。

このステップは、抗体滴定と呼ばれ、新しい抗体や様々な実験条件を用いるたびに実行する必要があります。また、ポリクローナル抗体の新しいバッチが前回のバッチと同じ性能を発揮していないことに気付いた場合にも、これを行う必要があります。

抗体力価の測定方法

多くの企業が抗体データシートに推奨希釈を記載しており、通常はこれが目安となります。しかし、推奨希釈を得るために使用された条件は、あなたが使用している条件とは大きく異なる可能性があるため、抗体の力価を測定することをお勧めします。製品データシートが1:1000の希釈使用を推奨している場合は、1:250、1:500、1:1000、1:2000および1:4000を順番に試してみてください。

一般的には、推奨されている希釈を2倍に、そして半分にすれば(また、それぞれの間で1段階とって希釈すれば)、正しい方向に向かっているはずです。推奨される希釈がない場合は、純化された抗体1μg/mlを出発点として試してみてください(濃度はデータシートに記載されているはずです)。サンプルタイプ、インキュベーション時間、洗浄時間、温度など、他のすべてのプロトコルパラメータを同じにすることを忘れないでください。

二次抗体に関する注意事項

特に化学発光検出の場合は、二次抗体の濃度も変えて試してみる必要があるかもしれません。HRP標識二次抗体の濃度は、バンドの外観に直接影響します。HRP酵素が少なすぎると、化学発光シグナルが低くなり、バンドが薄くなったり欠けたりします。一方、濃度が高すぎると「バーンアウト」バンドができてしまいます。これは、バンドの中心部で基質が急速に枯渇することによって引き起こされます。化学発光試薬のインキュベーションの長さも差異をもたらします(下記の6項「検出」を参照)。

4. ブロッキング条件

様々なブロッキングバッファーが用意されていますが、すべてがあらゆる状況で使用できるわけではありません。各抗体-抗原ペアに対して、いくつかのブロッキングバッファーを試すことが重要です。ミルクベースのブロッキングバッファーには、内在性ビオチン、糖タンパク質、シグナルに悪影響を与える酵素などが含まれていることを覚えておいてください。例えば、ミルクベースのバッファーには、活性型ホスファターゼが含まれており、リン酸化タンパク質の検出を妨害することになります。このようなケースでは、牛血清アルブミンベースのブロッカーなどの代替品を試してみてください。

5. 洗浄

ほとんどの場合、バックグラウンドシグナルが高いときには、次のランスルーの洗浄ステップを修正することが有用であることが証明されています。通常私は、Tween-20の濃度を0.05%から0.1%に増加しています。また、次のいずれかの方法を使用して、洗浄の強度を変更することができます。具体的には、洗浄時間と容量を増やす、追加のバッファーを変更する、またはより強力な洗剤を使用する(例えば、Tween 20の代わりにSDSを使用する)といったことです。ただ、やりすぎは禁物です。

6. 検出

検出ステージは、良好なウエスタンブロットシグナルを得るために不可欠です。化学発光試薬は数多くありますし、蛍光検出などの化学発光法の代替もありますので、現在の検出方法が研究室の基準を満たしていない場合でも、多くの選択肢があります。例えば、より感度の高い試薬や、より長いシグナルを生成する試薬を選択することができます。後者の選択は、ブロットの再現性を計り知れないほど向上させます。

より簡単なレベルでは、化学発光検出はフィルム露光時間で最適化することができます。これは、おそらく、迅速かつ容易なので、最も頻繁に実行される最適化ステップです。常に、個々のタイムポイントの範囲でブロットを露光してください(ただし、約10~15分後には、すべてのHRP基質が使い切られてしまうことを覚えておいてください)。フィルム選びでも違いが生まれます。標準的な放射線感受性フィルムではなく、化学発光検出のために特別に設計されたフィルムが最適な選択であると、いつも認識させられます。

7. ステップを省く!

実行するステップが少なければ、実験でうまくいかないことが少なくなり、そもそも最適化するステップが少なくなるのは理にかなっています。ここでは、蛍光イメージングなどの技術的な進歩や、HRP標識試薬といった簡単な試薬の変更が助けになるでしょう。

蛍光イメージングシステムは、まだすべてのラボで利用できないかもしれませんが、この技術を提供している中核、または中央施設があなたの研究機関にはあるかもしれません。蛍光ベース検出システムの直接的利点は、複数の抗体を同時に検出できることであり、ブロットをストリッピングしてリプロービングする必要がないことです。(ただし、ウエスタンブロットでの最初の試験で、同じインキュベーションで複数の一次抗体を使用した試験をしないことを断固としてお勧めします。蛍光イメージングが利用できない場合や、化学発光検出法を選択している場合は、特にそうです。最終的にこれをやりたいのであれば、試験するタンパク質や抗体についてよく分かるようになるまで待ちましょう。)

あるいは、一次抗体の二次検出を完全にスキップして、HRP標識一次抗体を使用することで、ウエスタンブロッティングプロトコルを合理化することができます。HRP標識一次抗体は、すべてのタンパク質標的に利用できるわけではありませんが、一般的なローディングコントロールとタンパク質タグがよく分かっているため、多くの時間を節約することができ、良い投資となる可能性があります。プロテインテック社のHRP標識一次抗体はこちら

まとめ

最適化の主な目的は、特定のバンドのS/N比を高め、非特定のバンド(存在する場合)を減少させることです。確かに、上記のすべての変数を最適化することを選択した場合、かなりの時間がかかります。しかし、1つまたは2つを変更しただけでも違いは生まれ、長期的には実際に時間を節約できる可能性があります。全体として、最適化は非常に価値のある仕事であり、出版物となりうるような質の高いウェスタンブロットを達成したいのであれば、必要な戦略だと考えています。

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Posted:
29 May, 2014

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