NEUROPILIN-1がSARS-COV-2のゲートウェイとしてACE2に加わります

Davyらは、Proteintech抗体とChromotek抗体の両方を用いて、2020年後半にScience誌に画期的な論文を発表し、SARS-CoV-2宿主細胞の侵入にNeuropilin-1がどのように必要であるかを詳述しました。

現在のコロナウイルス疾患2019(COVID-19)のパンデミックは、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)からの感染によって引き起こされます。SARS-COV-2に関する研究は、驚くほど多いにもかかわらず、ウイルス侵入のメカニズムについて多くの疑問が残っています。 現時点では、SARS-CoV-2スパイク(S)タンパク質が、宿主細胞膜上のアンジオテンシン変換酵素(ACE2)受容体に結合するというコンセンサスが得られています。その後、Ⅱ型膜貫通プロテアーゼであるTMPRSS2とHATがSタンパク質を切断し、Sタンパク質を活性化して、ウイルス膜融合とそれに続くウイルスRNAの宿主細胞への侵入を可能にします。また、プロテアーゼであるフリンが、Sタンパク質をS1サブユニットとS2サブユニットに切断し、感染性を高めることもあります。Science誌に掲載されたDavyらによる画期的な論文では、SARS-CoV-2のウイルス侵入機序における新規メディエーターとしてのNeuropilin-1の役割が記述されました (PMID 33082294)。Davyらは、呼吸器系および嗅覚系に豊富に発現しているNeuropilin-1が、細胞表面でフリンが切断されたS1断片に結合し、宿主細胞の侵入を増強することで、ウイルスのこれらの器官系に対する親和性に寄与していることを発見しました(図1)。

図1.Neuropilin-1を含むようにSARS-CoV-2宿主細胞侵入の概略図を更新しました。
HeurichらによるJournal of Virologyの論文から改作された画像。PMID: 24227843.

Neuropilin-1が細胞の侵入に影響を及ぼすかどうかを検証するため、Davyらは、ACE2、TMPRSS2、Neuropilin-1を異なる組み合わせでトランスフェクトした細胞のSARS-CoV-2感染能を検定しました。Neuropilin-1の発現だけでは、細胞は感染に至りませんでした。しかし、ACE2およびTMPRSS2と併せて発現させた場合、感染能は、ACE2およびTMPRSS2単独よりも顕著に増強されました。さらに、これらの細胞をNeuropilin-1の結合を機能的に遮断するモノクローナル抗体で処理すると、感染率は有意に低下しました。その後、研究者らは、Sタンパク質のフリン結合部位が破壊された突然変異型SARS-CoV-2を作製しました。 この突然変異体は、共発現したウイルス受容体細胞において感染を増強することができなかったことから、Neuropilin-1がその作用のためにfurin切断S-タンパク質と結合するのに必要であることが確認されました。次に、フリン切断に続くS‐蛋白質のC末端配列のペプチドを生成し、マウス嗅上皮へのin vivo投与のために銀ナノ粒子(AgNP)に結合しました。投与6時間後、対照ペプチドと比較して、S‐タンパク質ペプチドAgNPの有意に大きな取り込みが認められました。最後に、Davyらは、重度に罹患したCOVID-19患者由来の気管支上皮細胞のトランスクリプトミクスを調査しました。これらの患者では、Neuropilin-1、TMPRSS11a、およびフリンのRNA発現が有意に増幅されていました。興味深いことに、Neuropilin-1の免疫反応性は、ほとんど検出できなかったACE2に対して、ヒト肺上皮で非常に高く、Neuropilin-1の病原性の高い役割が実証されました。この研究は、ウイルス-宿主細胞相互作用を促進するNeuropilin-1の重要性を示し、COVID-19の将来の治療の新たな標的の可能性を提起します。

SARS-CoV-2感染のin vitroモデルとして使用するために、ACE2に対するプロテインテック社のモノクローナル抗体(66699-1-Ig)をウェスタンブロットで使用して、HEK-293細胞におけるACE2の過剰発現を定量しました。

ChromoTek社のGFP-Trap®およびRFP-Trap®は、特別なCo-IPアプローチで使用され、異なるGFP標識およびmCherry標識タンパク質構築物とVSV-Spike類似型ウイルスを共免疫沈降させ、ウエスタンブロット上で定量しました。例えば、mCherry-b1またはmCherry-b1T316Rタンパクは、HEK293T細胞で発現され、RFP-Trapによって分離されました。RFP-Trap上でmCherryタンパク質構築物を濃縮した後、VSV-Spike類似型ウイルスをあらかじめ負荷したビーズに加え、ウイルスを共免疫沈降させました。この設定を用いて、Davyらは、GFPまたはCherry標識タンパク質による通常の精製段階をスキップすることができ、代わりに、ビーズ上の細胞溶解物からそれらを捕捉し、タンパク質を使用してウイルス相互作用を分析し、定量することができました。


 

ACE2およびNeuropilin-1抗体を含むCOVID-19関連試薬に関する情報は、プロテインテック社のCOVID-19ページで見ることができます。ChromoTek社のナノボディベースの試薬に関する詳しい情報は、chromotek.comをご覧ください。

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Posted:
8 January, 2021

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