ヒントとコツ | 免疫組織化学のためのマウスオンマウス

マウス組織でマウス由来の抗体を使用したIHCの実験は、オフターゲット染色の可能性があるため、大変な作業になるかもしれません。これらの問題を軽減し、自信を持ってマウスオンマウス染色を実行する方法を学びます。

マウスモデルは、医薬品開発を促進するための、基本的な生理学を理解するのに役立つライフサイエンス研究で一般的に使用されています。免疫組織化学(IHC)は、マウス組織で使用される一般的な手法であり、その組織内の特定のタンパク質の関与と、それらが実験条件にどのように応答するかを視覚化します。免疫組織化学(IHC)の欠点の1つは、多くの抗体(特にモノクローナル抗体)がマウスで生成されることです。これにより、マウス組織で「抗マウス」二次抗体を使用すると、組織内の内因性マウスIgGおよびFC受容体に結合し、高いバックグラウンドおよび/または非特異的染色を引き起こす可能性があります。そのため、多くの研究者は当然のことながら、マウス組織でマウス一次抗体を使用することに慎重であり、それらを完全に回避する傾向があります。しかし、マウスオンマウス(MOM)を回避する必要はなく、この染色のヒントがあれば、マウス組織でお気に入りの抗体を引き続き使用できます。

ヒント1:試してみて(コントロールを使用して)確認してください!

MOM染色がいつ高いバックグラウンドまたは非特異的シグナルを示すかを予測することは困難です。そのため、ここでの最善の策は、最初に適切なコントロールを使用して自分で試して、バックグラウンド染色のレベルを明らかにし、結果の信頼性を評価することです。計画どおりにIHC実験を実行するだけですが、可能であれば、セカンダリのみのコントロールとアイソタイプコントロール*を含めるようにしてください。これらのコントロールにより、観察されたシグナルが、オフターゲットの二次抗体結合ではなく、特定の一次特異的二次抗体結合に由来することを確認できます。コントロールに不要な背景が表示されない場合は、問題ありません!後で問題が発生した場合に備えて、これらのコントロールをすべての実験に含めるようにしてください。 Proteintechでは、マウスの組織に高いバックグラウンドが発現し不満がある場合は、簡単な抗体保証により、すぐに返金可能です。その安心感を持って、マウスモノクローナル抗体の1つを試すことができます(手間がかからず、質問はありません)!

*アイソタイプコントロールを使用する場合は、プライマリと同じサブクラス(マウスには4つのIgGサブクラスがあります)であり、同じ濃度で、できればプライマリと同じメーカーのものであることを確認してください(こちらからPTGのマウスモノクローナルアイソタイプコントロールを確認できます)。

ヒント2:内因性マウスIgGのブロック

内因性IgGは、多くの場合、組織内の残留血液によって引き起こされます。したがって、MOM染色で高いバックグラウンドが見られる場合、最初のステップは、灌流または4%パラホルムアルデヒドでの浸漬固定の前に、動物を氷冷PBSで灌流することです。

実験で灌流が不可能な場合、または、まだ高いバックグラウンドが見られる場合、次のステップは、内因性マウスIgGのブロックを試みることです。一次および二次抗体で染色する前に、0.1 mg / mlの推奨濃度で抗マウスF(ab)フラグメント抗体とインキュベートします。これは、二次抗体宿主からの血清とインキュベートするという従来のブロッキングステップの後に行う必要があります。通常のヤギ血清、またはBSA + 0.5%Triton-X。この追加のブロッキングステップに続いて、通常どおり抗体染色を進めることができます。

補足:FFPE(ホルマリン固定パラフィン包埋)サンプルのFC受容体は、通常、IHCプロトコルの固定、脱水、パラフィン除去の各ステップで非活性化されるため、これらのサンプルでは問題になりません。ただし、それらが高いバックグラウンドの原因である可能性があると思われる場合は、この記事のヒント2〜4でこれを防ぐことができます。

ヒント3:抗体複合体を作成する

あるいは、組織とのインキュベーションの前に一次二次抗体複合体を作成することにより、MOM染色の問題を修正することができます。これはGoodpaster and Randolph-Habecker (2014)によって成功裏に示され、マウス一次およびf(ab)抗マウス二次を1:2の比率(二次抗体2µgあたり一次抗体1µg)で20分間インキュベートすることを推奨しています。それに加えて、正常なマウス血清と二次抗体の比率を10:1にして、さらに10分間インキュベートします。この複合体がスライドに追加され、続いてストレプトアビジン-HRPが検出されます。この方法は、組織に添加する前に二次抗体を一次抗体に結合し、残りの二次抗体はマウス血清によって結合されます。つまり、二次抗体によるオフターゲット結合はありません。これは図1にはっきりと示されています。ビオチンフリーラベリングの詳細とその他の方法については、こちらの記事をご覧ください。

図1.腎臓(A、B、C)、脾臓(D、E、F)、腸(G、 H、I)組織。抗マウス二次のみ(A、D、G)では、生物学的シグナルと間違えられる可能性のある多くの非特異的染色が観察されます。一次抗体を最初にf(ab)二次抗体と複合体化すると、アイソタイプコントロール(B、E、H)は予想どおりに染色されず、マウス抗SMA抗体(C、F、I)で特異的に染色されます。 SMA =平滑筋アクチン。Goodpaster and Randolph-Habecker (2014)、オープンソースからの図。

ヒント4:直接行ってください!

MOM染色から生じる問題の大部分は、二次抗体に起因するため、直接結合したマウス一次抗体を使用して方程式から二次抗体を削除することにより、これらを排除できます。現在、多くの抗体メーカーは、一次抗体に直接結合した検出酵素またはフルオロフォアを使用して抗体を作成しています。これには、IHCプロトコルの合理化、バックグラウンドの低減、解像度の向上、MOM二次抗体の問題の除去などの複数の利点があります。 Proteintechでは、人気のあるマウスモノクローナル抗体の多くがCoraLite色素に直接結合しており、IHC免疫蛍光抗体法で広範囲に検証され、最大3色のCoralite488 Coralite594 Coralite647で利用できます(図2)。Proteintechの製品範囲またはCoraLite色素直接結合抗体はこちらをご覧ください。

図2.CoraLite 488(A、D、G)に結合した精巣タンパク質BOULE(A、B、C)、DAZL(D、E、F)およびTNP1(G、H、I)に対する直接結合CoraLiteマウス一次抗体、CoraLite 594(B、E、H)およびCoraLite 647(C、F、I)。実験はマウスの精巣組織で行われました。

結論

IHC実験は、最も順調なときでさえ注意が必要な場合があり、特に、マウスオンマウス染色は困難な場合があります。高価な市販のキットを使用せずにこれらの問題を軽減する方法はたくさんあり、出版に値する結果を生み出せることを以上に示しました。幸運を祈っています!

Blog

Posted:
24 August, 2021

Share:


Back
to top