ライセート調製方法 : RIPAバッファーが最良な理由とは?

ウェスタンブロットでのライセートサンプル調製において、RIPAバッファーが最適な理由を解説します。

1979年に、Jaime Renartらは、「Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure(ゲルからジアゾベンジルオキシメチル紙へのタンパク質の転写および抗血清による検出:抗体の特異性および抗原構造の研究方法)」と題する論文を発表しました。これは、現代のウエスタンブロット(WB)法につながる技術です。

その後まもなく、Harry Towbinらはさらに一歩進んで、「Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications(ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロースシートへのタンパク質の電気泳動転写:手順およびアプリケーション例)」を発表しました。これにより、WB技術が正式に生まれました。

今日、WB実験は生物学研究の基礎となっています。残念ながら、良い結果を得ることは、高頻度での課題事項となり得ます。

賢者はかつて言っています:

WBの成功は以下に依存する:

10%は、試薬。

10%は、操作。

10%は、運。

70%は、タンパク質抽出。

ProteintechのR&Dスタッフは、全製品自社製造のオリジナルメーカーとして、平均70を超えるサンプルを試験しています。Proteintechの上級R&Dスタッフは、WBでの長年の経験を皆様と共有して、全てのWBが確実に成功するためのヒントを提供します。

溶解液(ライシス溶液)には何が入っていますか?

溶解液は以下の成分を含有します:

1.  バッファー系

溶液のpHは極めて重要です。生理的範囲外のpHの場合、タンパク質が沈殿したり、不安定になったりすることがあります。この状況を回避するには、Tris-HCl等のバッファー系が推奨されます。この範囲の溶液を緩衝することに加えて、Tris-HClバッファー溶液は生理的イオン強度を維持し、他のイオンとの不溶性産物の形成を防ぎます。HEPESバッファー系はもう一つの選択肢です。当社は、高濃度のカリウムを含むバッファーを回避することを推奨します。その理由は、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)が存在すると、タンパク質を沈殿させることがあるためです。

2.  塩イオン

塩イオン濃度が高すぎると、一部のタンパク質が沈殿する場合があります。さらに、イオン濃度が高すぎると、バンド移動によって「スマイリーフェイス」と呼ばれる泳動像になることがあります。

3. カオトロピック試薬

カオトロピック試薬は、タンパク質の疎水性を弱めて可溶化します。溶解バッファーに含まれるカオトロピック試薬は2種類あります:

a. 尿素/チオ尿素: これらの分子は、アミノ酸間の水素結合を破壊することによって、疎水性領域を解体します。通常、WBのためにタンパク質抽出を行う場合、6〜8M尿素および/または2Mチオ尿素を使用することができます。

b. 界面活性剤:これには幅広いクラスの界面活性剤が含まれます。その可溶化力の鍵は、両親媒性構造です。疎水性末端がタンパク質の疎水性部分に結合し、親水性末端が水と相互作用することによって、タンパク質を可溶化します。

イオン性界面活性剤は、カチオン性、アニオン性、および両性の界面活性剤にさらに分類できます。一般的なイオン性界面活性剤は、SDS、DOC(デオキシコール酸ナトリウム、sodium deoxycholate)、およびSLS(ラウリルサルコシンナトリウム、sodium lauryl sarcosine)です。一般的な両性界面活性剤は、CHAPS(3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホネート、(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)、およびCHAPSO(3-[(3-コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホネート、3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate)です。一般的な非イオン性界面活性剤は、Triton X-100、Triton X-114、Tween-20、およびNP40です。

Note: WBにおいては、タンパク質1分子に結合する負に帯電したSDS分子の数が、タンパク質の質量に比例することは極めて重要です。このことによって、移動速度は質量にのみ影響を受ける理由となります。溶解バッファーにカチオン性界面活性剤を加えると、SDS-タンパク質相互作用が破壊され、タンパク質は反対方向に移動します。

タンパク質の生化学は複雑であるため、あるタンパク質を抽出するのに最適な界面活性剤を予測することは困難です。したがって、問題に直面した場合は、様々な界面活性剤を試すことを推奨します。これは、特に膜タンパク質に推奨されます。

4. プロテアーゼ阻害剤

組織および細胞には、多くの場合、大量のプロテアーゼが含まれています。溶解中に、これらは放出され、次に、標的タンパク質を消化します。したがって、プロテアーゼ阻害剤は、標的タンパク質を保存するのに極めて重要です。一般的なプロテアーゼ阻害剤は、PMSF(フェニルメチルスルホニルフルオリド、phenylmethylsulfonyl fluoride)、アプロチニン(Aprotinin)、ロイペプチン(Leupeptin)、ペプスタチン(Pepstatin)、およびAEBSF-HCL(4-ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、4-benzenesulfonyl fluoride hydrochloride)です。PMSFは極めて有効であり、ライセート調製に最も人気のある選択肢です。

多くのプロテアーゼ阻害剤は、機能するのに二価金属イオンを必要とするため、プロテアーゼ活性の阻害には、多くの場合EDTA等の金属イオン封鎖剤(キレート剤)も使用されます。標的タンパク質がリン酸化されている場合は、さらにフッ化ナトリウム(sodium fluoride)やオルトバナジン酸ナトリウム(sodium orthovanadate)等のホスファターゼ阻害剤が、タンパク質のリン酸化形式を保存するのに必要です。特に、オルトバナジン酸ナトリウムは極めて有効ですが、溶液のpHを10に調整した後、溶液が無色になるまで沸騰させることによって活性化する必要があります。他のホスファターゼ阻害剤には、ピロリン酸ナトリウム(sodium pyrophosphate)やβ-グリセロール(β-glycerol phosphate)等があります。

5. 還元剤

多くのタンパク質は、ジスルフィド結合を介して多量体の形で存在します。還元剤は、これらの結合を破壊し、抽出されたタンパク質が単量体の形で存在するようにします。一般的な還元剤は、DTT(ジチオスレイトール、dithiothreitol)とBME(ベータメルカプトエタノール、beta-mercaptoethanol)です。このすべてを念頭に置いて、RIPAバッファーはサンプルライセートの調製に最適です。当社は、WBで13,000を超える抗体を検証し、RIPAバッファーを使用して何度も最良の結果を経験しています。当社は何年にもわたってバッファーを改良しており、以下はProteintechの最適化されたバージョンです:

RIPA バッファー For 1000ml
 50mM Tris HCl, PH 7.4  50ml
 150mM NaCl  8.76ml
 1% Triton X-100 or NP-40  10ml
 0.5% Sodium deoxylcholate  5g
 0.1% SDS  1g
 1mM EDTA (0.5M stock)  2ml
 10mM Naf  0.42g
 Add ddH2O to 1000ml
 使用直前にPMSFを添加して終濃度1mMとし、その他のプロテアーゼ阻害剤を加えます。
4 x SDS サンプルバッファー For 1000ml
 12% SDS 120g
 25% Glycerol 250ml
 150 mM Tris.HCl (pH 7.0 1M stock) 150ml
 0.03% Bromophenol Blue 300mg
 20% β-mercaptoethanol 200ml
Add ddH2O to 50ml, aliquot and store at -20°C

20% β-メルカプトエタノール(または500 mM DTTに置換)は、使用前に新たに添加する必要があります。

従来のライセートタンパク質の抽出で問題が発生した場合は、様々な抽出キットをランダムに試すのではなく、文献を読むことを推奨します。


関連: ローディングコントロール抗体
GAPDH Antibody
カタログ番号: 60004-1-Ig

GAPDH酵素は、広い細胞種で高く発現するため、ウエスタンブロット実験におけるタンパク質ローディングコントロールとして頻繁に使用されます。GAPDHは、解糖、DNA修復、アポトーシス等、いくつかの細胞機能にも関わることが知られています。

プロテインテックのモノクローナルGAPDH抗体は、ヒト全長タンパク質に対して作製されており、これまでに2,670報以上の文献で使用されています。

mouse monoclonal GAPDH antibody WB analysis of HeLa cells
Beta Actin Antibody (KD/KO validated)
カタログ番号: 66009-1-Ig

ベータアクチンは、全ての真核細胞タイプにわたって広範で一貫した発現を示し、また、このタンパク質の発現レベルはほとんどの実験的処理に影響を受けないことから、通常、ローディングコントロールとして用いられます。

66009-1-Igは、これまでに1,135 報以上で使用されており、様々な動物種で使用できます。

WB analysis of Jurkat cells using using beta actin antibody (66009-1-Ig)

プロテインテックのコントロール抗体は、お求めやすい価格 ¥29,000/150ul で提供しています。

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Posted:
31 October, 2016

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