IFイメージング:広視野および共焦点顕微鏡

実験上の問いにいかに効率よく答えるか。


はじめに

免疫蛍光(IF)は、細胞内の関心のあるタンパク質を可視化するために用いられる技術です。蛍光色素と直接共役した標的タンパク質に対する抗体を用いて細胞を染色するか、​蛍光色素と共役した二次抗体を併用して細胞を染色する技術に基づいています。

蛍光顕微鏡法は、蛍光プローブ、色素、またはタンパク質(蛍光体)を用いてサンプルを標識し、画像を生成するイメージング技術です。画像は、蛍光分子の特異的な励起に基づいており、光が蛍光体に吸収されてより長い波長で発光します。

現在使用されている蛍光顕微鏡のほとんどは、信号の励起と検出を同一光路(対物レンズ)で行うエピ蛍光広視野顕微鏡です。これらの顕微鏡は、生物学の分野で広く使用されており、共焦点顕微鏡のようなより高度な顕微鏡設計の基礎となっています(図1)。

共焦点および広視野顕微鏡

広視野顕微鏡(図1A)では、標識された標本から発せられた蛍光が、励起光に用いられたものと同じ対物レンズによって検出器に結像されます。ダイクロイックミラーは、接眼レンズや検出器へ蛍光を透過する波長特異的なフィルターとして機能します。

共焦点顕微鏡(図1B)では、レーザーで発光します。特定の光の波長がピンホールを通過して標本にあたり、ダイクロイックミラーによってこれが反射されます。ピンホールは、焦点面からの光だけを検出器に到達させることができます。これにより、焦点外の光の取得が少なくなり、画質が向上します(図2)。励起された蛍光体は、ダイクロイックミラーを通過する二次蛍光を発し、光電子増倍管(PTM)検出器ピンホールで共焦点として結像されます。

図1.広視野エピ蛍光顕微鏡A)および共焦点顕微鏡B)における画像生成

図2.広視野および共焦点顕微鏡における光路 - ピンホール原理の模式図


共焦点顕微鏡 対 広視野顕微鏡:利点と欠点

広視野顕微鏡の主な利点は、迅速に画像が得られ、接眼レンズで直接観察できることです。共焦点顕微鏡に比べて、メンテナンスコストは低いです。

一方、広視野顕微鏡は、バックグランドが高くなるリスクがあります。また、チャンネル間のブリードスルー(蛍光色素のスペクトルプロファイルが重複している場合)のリスクもあります。また、励起波長帯は、使用可能なフィルタセットに依存しますので、これが制限となります。

共焦点顕微鏡を使用することで、優れた画質を得ることができ、S/N比を向上させることができます。光散乱による画像のにじみを簡単に除去することができます。共焦点顕微鏡は、励起と発光の点で波長パラメータに柔軟性があり、チャンネル間のブリードスルーを低減します。倍率は、電子的に調整でき、標本の大きな表面をまたいでスティッチングすることも可能です。共焦点顕微鏡は、Z軸走査を効果的に行うことができるため、厚い標本を鮮明に観察し、3次元的に再構成することができます。

しかし、共焦点顕微鏡の使用には(走査速度にもよりますが)時間がかかりますし、広視野顕微鏡に比べて画像取得の手順が複雑になります。 また、共焦点画像は、PMT検出器からデジタルでしか得られません(接眼レンズを通して観察される信号は広視野画像です)。

自分の研究に最適な顕微鏡は?

ほとんどの用途では、広視野蛍光顕微鏡で十分であり、品質、スピード、使いやすさ、コストの面で最良なトレードオフが可能です。したがって、プロトコルの初期スクリーニングおよび生細胞イメージングのアプリケーションにとって完璧なツールであり、取得スピードの点で、共焦点による手法を用いてスキャンよりも利点があります(特定の染色のS/N比が十分である場合)。

まずは広視野顕微鏡を使用して、共焦点顕微鏡用のサンプル染色の質を確認することは、一般的に良いやり方だと考えられています(図3)。例えば、細胞内局在化やタンパク質-タンパク質相互作用の研究、コロケーション、厚い組織の3Dイメージング、あるいは標本のより大きな表面のイメージング(フィールド間のスティッチング)には、共焦点顕微鏡を使用することをお勧めします。また、マルチ蛍光イメージング、低速度イメージング、FLIM、FRAP測定にも対応しています。

図3.A)GLUT1抗体のSLC2A1(21829-1-AP)を1:50に希釈したものとAlexa Fluor 488標識AffiniPureヤギ 抗ウサギIgG(H+L)を用いた、広視野顕微鏡によるHeLa細胞の免疫蛍光分析。B)LAMP1抗体(55273-1-AP)を1:50に希釈したものとAlexa Fluor 488標識AffiniPureヤギ 抗ウサギIgG(H+L)を用いて(-20°Cエタノール)固定したHepG2細胞の、共焦点顕微鏡による免疫蛍光分析。DAPIを核対比染色に使用した。


顕微鏡のセットアップと適切なサンプル対照パネル

IFイメージングには、顕微鏡のセットアップと適切なサンプル対照が重要です。以下に重要なポイントをいくつか紹介します。

- マルチチャンネルの取得が計画されている場合、チャンネルのブリードスルーを減らすため、使用される蛍光体は、励起と発光のスペクトルプロファイルが狭いものを選択すべきです。

- 対照とサンプルは、バックグラウンドと偽陽性信号を除去するために、同一の設定を使用して並べて画像化すべきです。

- 各実験には、以下のような一連の実験対照を含める必要があります:

  • ノックアウト細胞または組織/細胞株、陽性および陰性対照
  • 二次抗体のみで染色したサンプル
  • 多重染色の場合は、各抗体を個別に検査すべきです。

選択する顕微鏡は、個々の実験の性質や、解明したい問いに最も効率的に答えるものはなにかによって異なります。

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Posted:
28 April, 2019

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