ヒントとコツ|質量分析実験を成功させるために

質量分析実験中で、最も一般的な障害に対処するためのトラブルシューティングガイドをご紹介します。


質量分析法は、基礎または高次の創薬研究でよく使われている手法です。単純な混合物中の化合物同定から、より複雑なサンプルセットの解析、すなわちプロテオミクスまで、幅広い応用範囲を備えています。

プロテオームとプロテオミクス

プロテオームは、生物内のすべてのタンパク質を総称する用語です。プロテオミクスは、環境の影響、本質的な変化(例えば、分化や細胞死)、細胞型、細胞コンパートメント、細胞周期のステージ下でのプロテオームのダイナミクスを研究することを意味します(1)。

質量分析法を用いたプロテオーム研究では、タンパク質量、アイソフォーム、修飾(ユビキチン化、スモイル化、リン酸化)での変化を明らかにすることができます。  In vivoでのタンパク質架橋(開裂性または非開裂性の架橋剤を用いる)では、これまで系統的な突然変異やハイブリダイゼーション研究でしか対応できなかった、特定のタンパク質-タンパク質相互作用についての詳細な知見を得ることができます(2,3)。

質量分析法は、多くの生物学的な疑問に答える新しい機会を提供してくれます。しかし、最新の質量分析法のその感度と複雑さゆえ、慎重なサンプル調製とデータ解析を必要とします。

質量分析実験を開始する前に考慮すべき、いくつかの点があります。

  • 実験の背後にある生物学的な疑問は何か、そして、質量分析法がそれに答えるのに役立つ可能性はどのくらいあるのか?
  • どのようなサンプルを使っているのか?
  • 関心のあるタンパク質はどのくらい量があり、それをどのくらい簡単に検出できるか?
  • タンパク質の修飾はどれくらい安定しているのか、タンパク質の分解を避けるにはどうすれば良いか?
  • 検出の妨げとなるサンプル汚染(ケラチン、ポリマーなど)を避けるにはどうすれば良いか?
  • 実験にはどのような対照が必要か?
  • 検出のために完璧なサイズのペプチドフラグメントを得るためには、どの酵素と消化タイプを選択すべきか?
  • 解析にはどのようなソフトを使えば良いか? 

質量分析データの解析に欠かせない4つのパラメータ:

A. 強度:

強度は、単一のペプチドがどれだけ豊富に存在するか、すなわちどれだけの頻度で検出されるかを直接測定するものです。この値は、もともとのタンパク質の量、ペプチドのサイズ、その「飛行する」能力に影響されます。 注記:質量分析ではすべてのペプチドが「飛行する」わけではありません。ペプチドがイオン化しなかったり、イオンが不安定で断片化していたりすると、検出に失敗することがあります。

B. ペプチド数:

これは、同じタンパク質に由来する、種々の検出されたペプチドの数です。ペプチド数が低いということは、タンパク質の量が少ないか、あるいはペプチド検出に最適なサイズではない(小さすぎるまたは大きすぎるかのいずれか)ということを意味します。この場合、消化時間を長くするまたは短くする、あるいは代替酵素を検討する必要があります。

C. カバー率:

カバー率は、ペプチド数に直接関連しており、検出されるペプチドが占めるタンパク質の割合を指します。カバー率の良好な度合は、それほど複雑でないサンプル(主に精製タンパク質を扱う場合)では40~80%です。この割合は、酵素認識部位の数や消化後のペプチドの長さに依存します。より複雑なプロテオームサンプルにおけるタンパク質のカバー率は1~10%の範囲であり、同定には十分な数字です。

D. P値/Q値/スコア:

ペプチドの結果/同定には、統計的有意性解析による検証が必要です。使用するソフトウェアにもよりますが、これはP値/Q値またはスコアで示され、<0.05でなければなりません。

P 値:ペプチドの同定が 「偽陽性」である期待値。

Q 値:FDR(False Discovery Rate;誤同定率 = 信号が有意でないにもかかわらず有意であると示される確率)に対して補足調整されたP値。

スコア(マスコット):ペプチドの同定がランダムなイベントである確率。


 

質量分析のトラブルシューティング

Q:サンプルにタンパク質が発現していたのでしょうか?

A: 入力サンプル(すなわち、細胞回収直後)をウエスタンブロットで確認します。

Q: 実験手順中、つまりサンプル処理時に、タンパク質が喪失したのでしょうか?

A:各実験段階でサンプル採取することを日常的に行い、そのタンパク質がサンプルであることを確認すべきです(ウエスタンブロットによる検証)。

Q:サンプル処理段階でタンパク質が分解されたのでしょうか?

A:一部のタンパク質は、さまざまな理由で分解に敏感な場合があります。サンプル調製の段階で、追加のプロテアーゼ阻害剤カクテル(アスパラギン、セリン、およびシステインプロテアーゼの広い範囲に対して有効なもの)をすべてのバッファに添加することをお勧めします(それらがトリプシン処理前に除去されることを確認してください!)。EDTAの入っていないカクテルを使用してください。PMSFをお勧めします。

Q:実験段階で相当量のサンプルが失われたのでしょうか?

A: 低濃度のタンパク質は、サンプル調製段階に失われやすく、または、高濃度のタンパク質の隣では検出できないことがあります。実験のスケールアップ、細胞分画プロトコルを使用した相対的なタンパク質濃度の増加、またはIPを使用した低濃度のタンパク質の濃縮を行ってください。

Q:「ペプチドが検出にかからなかった」場合はどうしたらよいですか?

A:不適切なペプチドサイズ(検出には長すぎたり短すぎたり)は、タンパク質シーケンス内のプロテアーゼ認識部位の不足/過多、またはタンパク質サンプルの消化過剰/不足に起因する場合があります。消化時間やプロテアーゼの種類を変更してみましょう。二重消化も選択肢の一つです(2種類のプロテアーゼの併用)。


 

5つの究極のヒント

ヒント1:

実験を始める前に: タンパク質の量、レギュレーション、および発現プロファイルを確認してください。プロテオームデータセットの場合:細胞周期のレギュレーションおよび細胞株の特性を確認します(例えば、がん細胞株は通常、転写レギュレーションまたはシグナル経路が乱れており、「制御されない」増殖を可能にしています)。

ヒント2:

フィルターチップ、単回使用のピペット、HPLCグレードの水を使用します。 プラスチックや溶液のオートクレーブ、およびガラス製品を洗浄するための洗剤の使用を避けてください!

ヒント3:

プロテアーゼ阻害剤、洗浄剤、EDTA、還元剤などのすべてのバッファ成分の妥当性を確認してください。バッファの塩濃度とpHを確認してください。

ヒント4:

低温ですべてのタンパク質サンプルを保管(4℃での作業/-20℃から-80℃の保存条件)してください。

ヒント5:

ウェスタンブロット/クマシー染色により、常に実験の各ステップを監視してください。

図1. 質量分析実験を成功させるための5つの究極のヒント


参考文献

1. Ly et al (2017) “Proteomic analysis of cell cycle progression in asynchronous cultures, including mitotic subphases, using PRIMMUS”

2. Rappsilber (2011) “A beginning of a beautiful friendship: Cross-linking/ mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes”

3. Paramelle et al (2013) “Chemical cross-linkers for protein structure studies by mass spectrometry”

Blog

Posted:
25 July, 2019

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