ヒントとコツ | 低分子量タンパク質のウェスタンブロット解析

低分子量タンパク質をウェスタンブロット解析する時のヒントとコツを解説します。

通常のSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング法は、分子量(MW)が約30キロダルトン(kDa)から250kDaまでの広範囲にあるタンパク質を調査する堅牢なツールです。しかし、MW域の極端な両端では、これらの手法には限界があります。すなわち、分離が不十分で、信号が減少したり、標的バンドがまったく存在しないことさえあります。低MWタンパク質(一般にMWが20 kDa未満のタンパク質)は、分解能や保持力の低下を起こしやすくなります。したがって、標準的なSDS-PAGEおよびウエスタンブロッティングのプロトコールで検出するのは困難です。しかし、検出することは不可能ではありません。これらの小さいMWを取り扱う際には、SDS-PAGEおよびその後のウエスタンブロッティングでの保持と分解能を向上させるために、複数のプロトコール変更を採用することができます。

トリシンの試行

上記で参照した「標準」ポリアクリルアミドゲルは、均一グラジエントのグリシン-Trisゲル(単にグリシンゲルと呼びます)です。一般に、グリシンゲルは、アクリルアミド混合物の合計パーセンテージ(T%)が分子量に応じて調整されるため、前述の範囲(30〜250 kDa)内に含まれるタンパク質を分解するのに理想的です。(この範囲の上限では約8%を使用すると最高の分解能が得られ、下限に向かって16%まで増加し、18%が使われることもあります。)しかし、Tris トリシンバッファーシステムに基づくアクリルアミドゲルは、30kDa未満で作業している場合に、標的バンドが「見える」可能性を大幅に向上させます。グリシンゲルで予想MW近くの前後で単一バンドが不明瞭に見える場合、トリシンベースのゲルでは、MWの異なる複数のよく分解されたバンドが見られます。(これらは、この時点以降トリシンゲルと呼びます。)この差は、アクリルアミド混合物のpHとT%が各ゲル内で同じである場合でも観察されます(つまり、6.8~8.8の通常のpHで、15%トリシンゲルと15%グリシンゲルとの比較)。

15%トリシンゲルのレシピは、Proteintechのウエスタンブロッティング完全ガイドの中にあります

ミオグロビンフラグメントのトリシン-SDS-PAGE(A)およびグリシン-SDS-PAGE(B)による分離の比較。Schäggerとvon Jagow1987より引用。

グリシンゲルとトリシンゲルの分離能力の違いは、グリシン化合物とトリシン化合物のpK値やイオン移動度などの特性が大きく異なることに起因します。ここではあまり詳しく説明しませんが、トリシンが低MWタンパク質の分離に最適である理由の基本的な説明は、グリシンとは異なる方法でタンパク質を「スタック」することです。スタッキング層の目的は、タンパク質を均一なバンドに詰めることです。これにより、「レース前にスタートラインに並んでいるランナー」のように、タンパク質のグループが同時に分離層に入ります。(たとえば、スミアバンドは、タンパク質がそのタンパク質「パック」から有利なスタートを切ったときに発生することがあります。)トリシンベースのスタッキング層は、スタッキングの上限(つまり、あるスタック内の最大のタンパク質の分子量)を最初のスタックの30kDaまで下げます。30 kDaマークを超えるタンパク質は、分離層に到達する前に30 kDa未満のタンパク質のスタックからすでに分離されているため、トリシンベースのスタッキング層は、ゲル層間の界面でのオーバーローディングを防ぎ、最小のタンパク質を含むスタックを最良の開始状態で分離させますref.1。トリシンのイオン移動度が高いということは、同じ程度の分離を達成するために、より低い割合のアクリルアミドをゲルに使用できることも意味します。したがって、高いアクリルアミド濃度(それでもまだ中程度ですが)を使用して狭い範囲の低MWタンパク質、例えば15%トリシンゲルを使って5〜20 kDaの範囲を分離することができます。しかし、5 kDa未満ならどうでしょうか?ゲル混合物に6M尿素を加えると、小さなタンパク質の分解能がさらに高まりますref.2。これは、5kDa未満の場合に推奨されます。

タンパク質の転写

低MWタンパク質の最適な分離を確保するだけでなく、タンパク質の転写段階でも注意を払う必要があります。低MWタンパク質は、「過剰転写」の影響を受けやすく、転写膜による保持の欠如および/または転写が速すぎるためにサンプルが失われます。

膜の選択と細孔径

ほとんどのラボでは、ニトロセルロースまたはPVDF(ポリフッ化ビニリデン)のどちらを好んでウエスタンブロッティングメンブレンに使用していますが、より小さい低MWのタンパク質の場合はPVDFの方が優れています。ニトロセルロースに比べ、より多量のタンパク質を結合する能力を持っています。ニトロセルロースのタンパク質結合能力は80〜100μg/cm2ですが、PVDFのタンパク質結合能力は170〜200μg/cm2ですref.3。この論文では、ウエスタンブロッティング用のメンブレンを選択する際に考慮すべきいくつかの検討事項について説明し、PVDFとニトロセルロースメンブレンの両方の微細構造の画像を提供しています(PVDFのタンパク質保持特性がわずかに高いという説明の一部です)。

どちらのメンブレンを選択する場合でも、様々な細孔サイズが提供されていることに注意してください。どちらも0.45μm、0.2μm、または0.1μmバージョンがあります。低MWの標的タンパク質のより良い転写を得るためには、より小さな細孔径のバージョンを選択してください。0.2μmのメンブレンは、20kDa未満のタンパク質での使用には十分なサイズです。Proteintechラボでは、低MWタンパク質の転写にMilliporeのImmobilon PSQPVDFメンブレンを使用しています。

転写条件

低MWタンパク質を扱う場合、メンブレンの選択に加えて、転写システム、時間の長さ、温度、バッファー組成などの他の要因も関係します。セミドライ転写システムは、この分野では湿式転写装置よりも優れているようです(おそらく、セミドライシステムは効率的な転写時間のため、過剰転写の影響を受けにくいという単純な事実によるものです)。しかし、セミドライ転写システムは再現性の問題に悩まされる可能性があることに注意してください(ただし、標的が低MWの場合はそれほど問題はないはずです)。

小さいタンパク質の場合、転写時間の長さと電圧(または設定によってはアンペア数)に関しては、短い/低い方が有効なことが多いです。これらをどの程度調整する必要があるかは、使用しているシステムのブランドとモデルによって異なります。機器のマニュアルで、30kDa未満のタンパク質に推奨される転写時間と電圧を調べてください。これらのどちらかが載っていない場合でも、製造元のWebサイトでこの情報を見つけることができます。

その他のヒント

ゲル上でサンプルを分析する場合、サンプルローディングバッファーにブロモフェノールブルーを使用しているかもしれませんが、一部のタンパク質は染料の移動先端から抜け出すことに注意してください。

転写をセットアップする前に、ゲルをSDSフリーバッファー(または単にH2O)に5分間浸すことを選択することができます。これは、小さなタンパク質とタンパク質フラグメントを負電荷でコーティングするSDSを除去するのに役立ち、ウエスタンブロットメンブレンを通過する速度を高めます。

良い結果を出してください!

 

参考文献

1. H Schägger and G von Jagow. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem. 1987;166(2):368-79.

2. H Schägger, Tricine-SDS-PAGE, Nature Protoc. 2006;1(1):16-22.

3. The Protein Man’s Blog, PVDF or Nitrocellulose – Which Membrane is Best? Nov 12, 2014:http://info.gbiosciences.com/blog/bid/203026/PVDF-or-Nitrocellulose-Which-Membrane-is-Best

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Posted:
26 August, 2015

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