定量的miRNAプロファイリング:最適なRNAシーケンシング法を選ぶには?

RNAシーケンシング(RNA-seq)は、広く用いられている方法であり、次世代シーケンシング(NGS)を使用して生体サンプル中のRNA分子の存在量を発見し、定量化することができます。


なぜRNA-seqを行うのか?

RNA-seqは、トランスクリプトミクスのアプローチに革命をもたらし、マイクロアレイやEST(expressed sequence tag;発現配列タグ)シーケンシングに比べて、高スループットで正確かつ高いコスト効率でRNA解析を可能にしています[1](表1)。

パラメータ DNAマイクロアレイ ESTシーケンシング RNA-seq
検出方法 ハイブリダイゼーション サンガーシーケンシング NGS
感度 あるが制限あり - 発現レベルの変化を最大10,000倍まで検出 限定的 - 小さいRNA(ある - シーケンシングの深度を増すことで低発現RNAの検出が可能;1塩基分解能
必要なRNAの量 多い/中程度 - 1~10 ng 多い - cDNAライブラリが必要 少ない - 単一細胞解析が可能
コスト 中程度 高い/中程度 - 大半がcDNAライブラリとサンガーシーケンシングコストに関連 低い

RNA-seq技術は、基礎研究や臨床研究のアプリケーションに広く利用されています(図1)。

主な用途:

  • コーディングRNAとノンコーディングRNA、スプライス部位、アイソフォーム、オープンリーディングフレームの同定による、ゲノムの機能的アノテーション
  • RNA発現の定量的解析と発現プロファイリング
  • 一塩基多型の検出
  • RNA編集の研究 - RNA転写後修飾(PTM)の研究

特殊なRNA-seqセットアップをすることで、RNAのサブセット、例えばコーディングRNA(mRNAシーケンシングとエクソームキャプチャー)またはリボソームRNA(リボソームプロファイリング)に焦点を当てることができます。RNA検出の感度が向上したことで、単一細胞のシーケンシング(1細胞RNA-seq)が開発され、組織の複雑性や異種細胞集団を単一細胞レベルで研究するための貴重なツールとなっています。

RNA-seqは、RNA構造を決定したり(プライマー伸長による選択的2′-ヒドロキシルアシル化分析 - SHAPE)、RNA-RNAとRNA-タンパク質の相互作用部位をマッピング(架橋免疫沈降 - CLIP)するために開発されました。

図1.基礎研究および臨床研究におけるRNA-seq技術のアプリケーション

small RNA-seqの課題

ちょうど10年前に開発されたRNA-seqは、最初、メッセンジャーRNAを含むポリAに対して適用されました[2-4]。標準的なRNA-seq(「long RNA-seq」)は、メッセンジャーRNAと長いノンコーディングRNAのシーケンシングに使用されます。これは、RNAの単離後、それが所望の長さ30~400 bpに断片化され、次にcDNAに逆転写される技術に基づいています。逆に、成熟したmicroRNA(miRNA)のような約22ヌクレオチドのsmall RNAは、標準的なRNA-seqプロトコルには小さすぎます。miRNAは、長さが短いため、偏りのない効率的な逆転写やポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅を可能にするためには、ライブラリ調製時の伸長(RNAライゲーションやポリAテーリングなど)という追加的なステップが必要となります(「small RNA-seq」、図2)。特に、血中に循環する無細胞miRNAの検査など、RNA量が少ない生物学的サンプルでは、適切な正規化と再現性の評価が必要です。Giraldezら [5]は、Nature Biotechnologyにおいて、9種類の異なるライブラリ調製法のベンチマークテストを行い、それらの再現性、精度、およびmiRNA編集の検出能を評価しました。

これは、次の3つの基準サンプルを用いて行われました。

1)等モル比の1,000以上の短い合成RNAプール

2) 異なるモル比で混合された合成のsmall RNAプール

3)ヒトの血液から単離されたsmall RNAプール。

9つの独立した研究グループが、複製物を調整しライブラリを解析した結果、364という膨大な数のRNA-seqデータセットが得られました。

small RNA-seqの様々な方法

small RNA-seq実験を行うために開発された、市販キットおよび内部開発の方法がいくつか存在します。ほとんどの利用可能な方法は、3'および5'末端のアダプターライゲーションを必要とします。これは、増幅されたRNAの品質と選択性に直接影響を与える重要なステップです。ライゲーションステップで使用されるRNAリガーゼ(Rnl1およびRnl2)は、特定のRNAサブセットの過剰発現および発現低下をもたらす配列および構造的バイアスを有することが実証されています[6, 7]。small NA-seqに対する現在のプロトコルと戦略は、2つのカテゴリに分けることができます。すなわち、インバリアントな末端を持つアダプターを利用するもの(アダプターは予め厳密に定義された配列を有す)、および、ライゲーション末端に4つの変性ヌクレオチドを含むアダプター(4Nアダプター)を有するものです(図2)。

Giraldezらは、インバリアント末端を用いて、TruSeq(Illumina)、NEBNext(New England BioLabs)、CleanTag(Trilink Biotech)の3つの市販キットについて評価しました。また、4Nアダプターについては、市販のNEXTflex(Bioo Scientific)、最近Pingら[8]によって公表されたプロトコル、および4つの内部開発プロトコルの計6つのプロトコルを評価しました。

図2.small RNA-seqの実験手順。単離されたsmall RNAは、3'および5'末端アダプターで2ラウンドのライゲーションを受け、これらの反応は2つのRNAリガーゼによって触媒される。得られた生成物は逆転写のテンプレートとなり、DNA断片は数サイクルのPCRで増幅される。増幅されたDNA生成物についてシーケンシングを行う。Giraldezら[5]は、インバリアント末端またはそのライゲーション末端に4つの変性ヌクレオチドを有するアダプターのいずれかを含む3'および5'末端アダプターを使用して9つのプロトコルを比較した。図は、単に単純化する目的のため、3'末端アダプターのバリアントのみを示している。

1st sequence-biasは大きな問題

Giraldezら[5]は、現在使用されているsmall RNA-seqプロトコルがシーケンスバイアスの問題を抱えていることを報告しています。異なるプロトコル間に観察されるシーケンスバイアスは、同じプロトコルを使用して異なる研究グループが生成したデータセット間よりも有意に高く、RNA-seqのプロトコル選択が、得られるデータの質に大きな影響を与えることを示唆しています。このことは、異なるライブラリ調製プロトコルを用いて解析した、類似の生物学的現象についてsmall RNA-seqの結果を比較する際には留意しておかなければなりません。4Nアダプター法は、インバリアントアダプター法に比べてシーケンスバイアスが小さく(プロトコルにより2~20倍)、したがって、好ましい選択肢です。また、4Nアダプタープロトコルにおけるシーケンスバイアスの低さは、たとえシーケンシングの深度が低い場合でも、様々なsmall RNA種を検出しつつも(サンプルカバレッジ)良好なパフォーマンスを発揮するに違いないことを示唆しています。

2nd RNA-seqプロトコルは正確で再現性が高い

予め定義され合成されたsmall RNAプールを使用することにより、異なる研究グループ間の精度と再現性について、すべてのプロトコルの比較が可能になりました。観察されたmiRNA量の比は、予想された比に非常に近似しており、これは、すべてのプロトコルが正しい相対miRNA量を得るために正確であったことを意味します。再現性は、合成および生物学的small RNAサンプルにおいて、統計的パラメータ(変動係数、四分位分散係数)により測定しました。詳細な結果は補足データセットに要約されています(同定されたRNAのほとんどの係数変動は20%未満でした)[5]。

3rd miRNAの検出は、自社開発の4Nアダプタープロトコルの場合で最も信頼性が高い

アデノシン残基のイノシンへの脱アミノ化(A-to-I編集)は、miRNA前駆体のサブセットで発生することがあります。これは、さらなるプロセスや生物学的活性に影響を与えます[9]。したがって、研究者らは、A-to-IのmiRNA編集の正確な検出を可能にする適切なRNA-seq法を使用することが重要です。Giraldezら[5]は、異なるモル比で混合された編集済みおよび未編集の合成small RNAを標準プールに使用しつつも、9つのプロトコルのうち3つがA-to-I miRNA編集を検出できると評価しました。検討されたプロトコルはすべて、サンプル中の編集済みおよび未編集のRNAを確実に検出してこれらを識別するのに、良好な特異度(>99%)を示しました。しかし、実際の編集レベルを正確に検出するという点では、社内の4Nアダプタープロトコルの方が市販のインバリアントアダプタープロトコルよりも優れたパフォーマンスを示しました。これは、4Nアダプタープロトコルの方がシーケンスバイアスが低く、シーケンスカバレッジを最大化できるという事実のため、インバリアントアダプタープロトコルよりも性能が上回るということに起因している可能性が高いです。

さらなる改善が必要です...

疑いの余地もなく、この包括的な研究は、研究者らがsmall RNA-seqのプロトコルや実験デザインの詳細について、より深くフォローアップするのに役立ちます。small RNA-seqは、long RNA-seqと比較すると、依然として大きなシーケンスバイアスを示します。重要なことは、4Nアダプターを使用したsmall RNA-seq解析の最近の研究では、シーケンスバイアスが低く抑えられているようだということです。検証した4つの4Nアダプタープロトコルが、異なる品質のデータセットを生成したことは、言及する価値があります。これは、small RNA-seqに関する実験を行う際には、ライゲーション時間や温度などの追加パラメータを考慮する必要があることを示唆しています。


参考:

「定量的miRNAプロファイリングのためのsmall RNA-seq法の包括的な多施設評価」 Nature Biotechnology 36巻、746-757ページ(2018年)

投稿者:Karolina Szczesna博士、プロテインテック社シニアプロダクトマネージャー兼テクニカルサポート

参考文献

  1. Wang, Z., M. Gerstein, and M. Snyder, RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet, 2009. 10(1): p. 57-63.
  2. Mortazavi, A., et al., Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods, 2008. 5(7): p. 621-8./li>
  3. Nagalakshmi, U., et al., The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science, 2008. 320(5881): p. 1344-9.
  4. <Wilhelm, B.T., et al., Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature, 2008. 453(7199): p. 1239-43.
  5. Giraldez, M.D., et al., Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nat Biotechnol, 2018. 36(8): p. 746-757.
  6. Jayaprakash, A.D., et al., Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res, 2011. 39(21): p. e141.
  7. Zhuang, F., et al., Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Res, 2012. 40(7): p. e54.
  8. Ping, X., et al., An improved protocol for small library construction using High Definition adapters. Methods Next-Generation Seq., 2015(2): p. 1-10.
  9. Yang, W., et al., Modulation of microRNA processing and expression through RNA editing by ADAR deaminases. Nat Struct Mol Biol, 2006. 13(1): p. 13-21.
Blog

Posted:
11 October, 2018

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