ウェスタンブロッティング用のプロテアーゼ:適切なツールの選択

プロテアーゼはしばしば、ウエスタンブロット(WB)解析を複雑にする「悪者」として見られています。これらは、標的タンパク質を認識できないほどに切断し、期待された結果とは似ても似つかないものにしています。


これに役立つ酵素には、ホスファターゼグリコシダーゼの2種類があります。

ホスファターゼ

まずはホスファターゼから見てみましょう。シグナル伝達経路の研究では、タンパク質のリン酸化と脱リン酸化がいたるところで起こります。タンパク質のリン酸化はプロテインキナーゼによって触媒され、脱リン酸化はホスファターゼによって触媒されます。

リン酸化されたタンパク質のWB解析では、予測された分子量の近辺で、2つの近似バンドが存在することがよくあります。上のバンドがリン酸化された形態であるかどうかを試験するために、ホスファターゼを使用することができます。(下のバンドではなく)上のバンドの消失または弱体化は、上のバンドがそのタンパク質のリン酸化された形態であることを示しています。

プロテインテック社では、常にホスファターゼで作業を行い、リン酸化されたタンパク質を標的とする抗体の特異性を検証しています。例として、RIPK1 Phospho-S161モノクローナル抗体(66854-1-IG)があります。下記のバリデーションデータ(図1)では、ホスファターゼ処理後、いくつかの細胞溶解物中のシグナルが消失しました。


図1.種々の溶解物をSDS PAGEに供した後、1.5時間室温でインキュベートした1:5000希釈の66854-1-Ig(RIPK1 phospho-S161抗体)を用いてWBを行った。細胞溶解物を、未処理(左)のまま、またはラムダプロテインホスファターゼ(lamda-PPase、500U、右)で1時間37℃で処理したあと、ブロッキングステップに移った。

ここで注意すべきことがあります。それは、市販されているホスファターゼの多くは、溶解バッファーによって不活性化されているということです。したがって、メーカーに確認してから実験で使用することをお勧めします。

グリコシダーゼ酵素

次に、グリコシダーゼについて見てみましょう。私たちは、WBにおいて、観察される分子量が計算値よりもはるかに大きいタンパク質(特に膜タンパク質)に遭遇することがよくあります。この不一致の原因の一つとして考えられるのは、グリコシル化です。この仮説を検証するために、グリコシダーゼ酵素を用いることができます。グリコシダーゼ処理後に分子量が計算値まで低下した場合、そのターゲットは、糖タンパク質である可能性が高いです。

プロテインテック社では、糖タンパク質を標的とするすべての抗体の検証を定期的に行っています。例えば、当社のCD2モノクローナル抗体(60005-1-IG)が挙げられます。CD2は、351のアミノ酸で構成されており、計算上の大きさは39kDaです。しかし、そのターゲットは、グリコシル化された形態では約50kDaになります。この乖離がグリコシル化によるものであることを確認するために、私たちは、タンパク質からアスパラギン結合型のグリコシル基を切断するグリコシダーゼPNGase Fを用いました。以下に、Jurkat細胞を用いた結果を示します(図2)。PNGase F処理後、標的タンパク質は計算値付近まで移動します。


図2.未処理およびPNGase F処理Jurkat細胞溶解物をSDS PAGEに供した後、1.5時間室温でインキュベートした1:3000希釈の60005-1-Ig(CD2抗体)を用いてWBを行った。

 

よく用いられるグリコシド酵素は3つあります。

  1. PNGase F - アスパラギン結合型炭水化物のほとんど全てを切断します。
  2. EndoH - 高マンノースといくつかのハイブリッドタイプのN結合型炭水化物を切断します。
  3. O-グリコシダーゼ - セリン残基とスレオニン残基からO結合型炭水化物を切断します。

グリコシラーゼの実験では、トラブルシューティングが必要になることがあります。下記のFAQをご覧ください。

 

問題

可能性のある原因

解決策

酵素消化後の変化なし

1. 選択された酵素は、溶解バッファーと相性が良くない。

2. 酵素量の不足やインキュベーション時間の不足。

3. 検出能が足りない。

4. 標的タンパク質が修飾されていない。

1. 酵素との相性をメーカーに確認します。

2.これらのパラメータの量を変化させて試験を行います。

3. 適切な濃度のゲルを使用して、近似バンドを分離します。

4. 他の実験と組み合わせて、修飾の有無を確認します。

想定されるグリコシル化物質が、消化後にわずかに弱くなる

1. 酵素量の不足やインキュベーション時間の不足。

2. 標的シグナルが、2つのタンパク質または同じタンパク質の2つの形態によって生成されている。

1.酵素の使用量を増やす、またはインキュベーション時間を延長します。

2. 他の実験を組み合わせて、他の修飾または無関係のタンパク質干渉の存在を確認します。

消化後の酵素の大きさが計算値と一致しない

1.酵素量の不足やインキュベーション時間の不足。

2.タンパク質が他にも修飾を受けている。

1. 酵素の使用量を増やす、または酵素での切断時間を延長します。

2. 他の実験と組み合わせて他の修飾を検証します。

 

ホスファターゼ、グリコシダーゼなどのプロテアーゼを使用する場合、それぞれの酵素はそれに適した実験環境があります。実験の設計が合理的で健全なものであれば、多くの酵素はあなたにとって便利な道具になってくれるでしょう!

 

ここでは、プロテインテック社の酵素を使った実験の一部をご紹介します(図3~6)。

 

図3.未処理およびPNGase F処理のJurkat細胞溶解物をSDS PAGEに供した後、1:8000希釈の66065-1-IG(CD31抗体)を用いたWBを行った。
図4.未処理およびPNGase F処理のブタ脳サンプル溶解物をSDS PAGEに供した後、1:2000希釈の66667-1-IG(EPHA7抗体)を用いてWBを行った。

 

 

 

図5.未処理およびPNGase F処理のHT-29およびCACO2細胞の溶解物をSDS PAGEに供した後、1:5000希釈の66666-1-IG(CD133抗体)を用いてWBを行った。

 

 

 

図6.未処理およびPNGase F処理のRaji細胞溶解物をSDS PAGEに供した後、1:20000希釈の66103-1-IG(CD22抗体)を用いてWBを行った。
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Posted:
31 July, 2019

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