質量分析法の必須事項

質量分析(mass spec; MS)は、高分子を分析するための強力な方法です。


質量分析は、純粋またはより複雑なサンプル混合物をイオン化した後の質量(m)と電荷(z)に依存します。

技術的な機器と解析ソフトウェアの両方の急速な進歩のおかげで、21世紀の間にアプリケーションの範囲と汎用性が大幅に拡大しました。質量分析は、「単純な」化合物やペプチドの同定には依然としてよく使用されていますが、最近のアプローチはより大規模なデータセットを対象としたターゲット解析に焦点を当てたものになっています。

質量分析は、次の3つのステップに分けることができます:

1. サンプル調製

2. サンプル精製

3. データ分析(図1)

図1.質量分析は、サンプル調製、サンプル精製、データ分析の3つのステップで行うことができる。


1.サンプル調製

タンパク質の量

質量分析法は、フェムト幅のタンパク質を検出することができる、最も感度の高いタンパク質検出法の一つです。

しかし、これらの能力が発揮できず、モニタリングと検証が必要な場合もあります。細胞内タンパク質濃度が低い場合、タンパク質が分解されやすい場合、またはタンパク質が細胞内コンパートメントを占有している場合、複雑なサンプルセットにおいて、検出時により豊富な細胞質タンパク質が、関心のあるタンパク質からのシグナルをマスクしてしまうことがあります。

サンプルを質量分析に供する前に、起こり得る問題の発生を予測するため、SDS PAGEによって、または好ましくはウェスタンブロットによって、実験全体を通してモニタリングすべきです。

低濃度のタンパク質を濃縮するためには、免疫沈降法や細胞分画法が考えられます。細胞分画を行う場合は、細胞コンパートメントの適切な分離を確認するするため、細胞オルガネラマーカーのウエスタンブロットを並行して実施し、これを検証しなくてはなりません。

対照

必要な対照のセットは実験によって変わります。

定性的実験:

例としては、免疫沈降法やキナーゼアッセイなどがあります。ここでは通常の生物学的対照が機能します。例えば、「抗体なし」、「タグなし」、「キナーゼなし」、「野生型 対 変異型」などです。

相対定量化:

これには、代謝標識(SILAC: Stable Isotope Labelling by Amino acids in Cell culture;細胞培養物中のアミノ酸を使用した安定同位体標識法)や、化学標識(TMT: Tandem Mass Tags;タンデムマスタグ分析法)が含まれます。これらの方法の概要については、以下の図2を参照してください。最大3サンプル(SILAC)または10サンプル(TMT)の間でのペプチド量の違いをモニタリングすることができます。結果として得られるデータセットの検証には、複数の同位体標識アミノ酸を使用することが不可欠です。これは、系統的なエラーを除外するために、サンプルの逆標識を行って生物学的複製を分析することを意味します。最も低価格で、最も精度の低い手法は、無標識の定量化で、この方法では、2つの別々の実験によるスペクトルをAUC(曲線下面積)またはスペクトルカウントで比較します。

絶対定量化 (AQUA):

サンプルの質量分析中に、既知の濃度の標識された合成ペプチドの信号が「スパイク」します。したがって、これは精度の高い方法となっています。しかし、標識ペプチドを合成する必要があるため、かなりのコストがかかります。

 

図2.相対的定量法:代謝標識対化学標識。

タンパク質の安定性とその修飾

混合物中にプロテアーゼ(またはホスファターゼ)が存在する可能性がある場合は、サンプル混合物に十分な阻害剤を添加することを忘れないでください。

実験中は、タンパク質分解活性を最小化するために、低温(4℃)でできるだけ多くのステップを実行することをお勧めします。プロテアーゼ阻害剤は、トリプシン消化(または使用される他のプロテアーゼ)を阻害するため、質量分析のサンプル調製の前に、混合物から取り除く必要があります。

汚染物質

表面、容器、チップ、溶液はすべて清潔にして、ケラチン汚染を防ぐ必要があります。これは量が大変多く、信号をマスクする可能性があるためです。

ポリマー、特にPEG(ポリエチレングリコール)も汚染の原因となります。PEGは、ガラス製品の洗浄に使用される洗剤に由来するか、またはオートクレーブ滅菌中にプラスチック容器やチップから放出されることがあります。

すべての作業溶液にはHPLCグレードの水を使用し、オートクレーブ滅菌されていないフィルターチップ、単回使用のピペット、低タンパク質結合型のチューブを使うのが最も適しています。また、ポリマー汚染は、親和性のカラム材料に由来することもあります。その場合は、追加の洗浄ステップとしてトリプシン消化および抽出を行う前に、サンプルをゲル上で実行することを検討してください。プレキャストゲルは、ケラチン汚染のリスクが少ないためお勧めです。セルフキャストゲルの場合は、HPLCグレードの水を使用し、エタノールですべての材料を完全に洗浄します。


2. サンプル精製

酵素消化

還元とアルキル化の後、タンパク質は適切なサイズのペプチドに消化する必要があります。検出に最適なペプチド長は8~15アミノ酸です(1)。

消化に最もよく使われる酵素は、トリプシンです。

注記:消化後のペプチド長は、無料で利用できるオンラインソフトウェアPeptideMasshttps://web.expasy.org/peptide_mass/)を使って予測することができます。トリプシン認識部位が十分でないか、または多すぎる場合は、他のプロテアーゼを使用して、より適切な範囲のペプチドを生成することができます。

ゲルまたは溶液中での消化

タンパク質は、溶液中で直接、またはゲル上で実行した後に消化することができ、そのあとに消化されたペプチドを抽出します。

溶液中
利点 サンプル材料の損失なし。
欠点 バッファはトリプシン消化と互換性のあるものでなければならない。
 
ゲル中
利点 ポリマーのような汚染物質を防ぐための追加的洗浄ステップ;レーンを異なる画分に切断し、そのサイズに応じてタンパク質をさらに分離可能。
欠点 サンプル材料の損失あり。

洗浄

汚染物質、塩類、バッファを除去するためには、質量分析を行う前の最後のステップとして洗浄工程が必要です。最もよく使用されているのは、疎水性ペプチドを結合させるC18カラム(逆相レジン)で、塩類や親水性汚染物質を洗い流すことができます。

次いで、ペプチドを有機溶媒で溶出することができます。SP3(Single-Pot Solid-Phase-enhanced Sample Preparation;シングルポット固相増強サンプル調製)のような最新の方法では、タンパク質を磁気ビーズに結合させて、洗浄と消化を直接行うことができるため、より厳密な洗浄が可能となり、材料の損失を最小限に抑え、再現性を高めることができます(2)。


3. データ分析

データベース

  • UniProthttps://www.uniprot.org )から自分の実験や生物に適したタンパク質データベースを選択し、その最新版を自分の質量分析ソフトウェアにロードしてください。
  • いずれかのタンパク質にエピトープタグが含まれている場合は、データ分析に使用するデータベースにそのタンパク質のタグ付けされた配列が含まれていることを確認してください。

可逆性架橋剤

  • サンプル精製の前に注意すべきこととして、架橋試薬は、化学的に切断され、相互作用するタンパク質は追跡可能な修飾を残したままになっています。この修飾をデータベースに含めてください。

非可逆性架橋剤

  • 架橋ペプチドは、異なるタンパク質に由来することがあるため、データの解釈には専門のソフトウェアとガイダンスを使用してください。これは、データ分析をさらに複雑にさせるものです。

再現性

  • 全プロテオームデータセットを解析する場合は、1つの実験で検出されたすべてのペプチドの一つひとつがガウス分布に従うことを確認してください。
  • 異なる生物学的複製から得られたデータセットは、互いに一致していなければなりません。そうでない場合、結果は無効です。
  • ペプチドの結果/同定は統計的に有意でなければなりません。p値(また、ソフトウェアによっては、Q値またはスコア)は<0.05でなければなりません。

参考文献

1. The value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics.

2. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.

Blog

Posted:
12 February, 2019

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