ライセートの調製:抽出を最適化するには?

ウェスタンブロットでのライセートサンプル調製において、抽出条件の最適化について解説します。

1. 細胞溶解(Cell lysis)

サンプルが浮遊細胞培養の場合は、細胞を遠心分離によって直接回収することができ、PBSまたは生理食塩水で2〜3回洗浄して培地中の血清を除去します。接着細胞の場合は、トリプシン処理が一般的ですが、トリプシンは目的のタンパク質も消化することがあるため推奨されない場合があります。代わりに、可能であれば、接着細胞をこすり落とすことを推奨します。浮遊細胞または接着細胞のどちらを使用していても、後のプロセスは同様です。細胞溶解プロセスでは、溶解バッファーを添加し、サンプルを超音波処理してから、遠心分離を行います。その後、少量を使用して濃度を決定し、残りをWB(ウェスタンブロット)に使用します。

2. 組織ライセート

組織タンパク質の抽出はさらに複雑です。最初のステップは目的のサンプルをきれいに切離することであり、これは最も重要なステップです。サンプルを取り出したら、PBSで洗浄し、血液による汚染を除去する必要があります。これにより、二次抗体が内在性の免疫グロブリンに結合することに起因する非特異的シグナルを防ぎます。洗浄後、サンプルを均質化(ホモジナイズ)します。ホモジナイズ後の一般的な手順は、培養細胞を用いる場合の手順と同様です。しかし、培養細胞サンプルとは異なり、組織は結合組織に富んでいることが多く、従来のライシスバッファーに溶解するのが難しいものもあり、結果を最適化するための実験が必要なこともあります。

タンパク質分解の防止

前述のように、多くの組織や細胞にはプロテアーゼが含まれています。サンプル調製中にこれらの酵素の働きを抑制する方法として、次のような例があります。

1. プロテアーゼ阻害剤の使用

PMSFおよびEDTAはどちらも安価でありながら、極めて効果的な阻害剤であるため、ほとんど全てのWB実験で使用されています。

2.低温での手順の実施

一般的な哺乳動物組織または細胞のタンパク質サンプルを調製する場合、すべてのステップを低温で実施し、さらに全ての試薬をあらかじめ冷却することによって、プロテアーゼ活性を低下させ、タンパク質の分解を防ぐ必要があります。特に、消化器系に関連する組織サンプルは、可能な限り迅速に処理する必要があり、液体窒素中で瞬間冷凍した後に粉砕する調製方法を取り、サンプルの分解を最小限に抑える必要があります。

しかし、ゼブラフィッシュのように、低温で最も活性が高いプロテアーゼを持つ種もあります。このような場合は、低活性になる高温(50℃~60℃)で行われる場合もあります。

3. 複数の臓器からサンプルを採取する場合、プロテアーゼ活性によって切離する順序を決定する

消化器系に関連する臓器、およびマクロファージが豊富な組織(肺等)を、最初に切離・急速凍結する必要があります。次に、生殖組織を処理する必要があります。心臓、脾臓、腎臓、脳、その他の臓器は、最後に切離することができます。

細胞株のなかには、Raw 264.7や U-937などのように、高プロテーゼ活性を持つものがあります。このような場合は、高濃度の SDSを使用して抽出プロセスを速めることを検討します。

不純物の混入防止

組織や細胞には、タンパク質以外にも多くの物質が含まれており、これらはWBの妨げとなることがあります。サンプル中の不純物を軽減するためのいくつかの戦略を以下に示します。

1. 交差汚染(クロスコンタミネーション)の防止

抽出中に使用するツール、特にホモジナイザー、摩砕用乳棒、解剖器具等の機器は、滅菌済みの清潔なものを使用します。タンパク質抽出の収率を向上させるため、プロテアーゼの使用は避けてください。

2. サンプルを超音波処理して核酸を除去

核酸は、タンパク質に結合して分析を妨げることがあります。調製したサンプルに大量の核酸が含まれていると、標的タンパク質の移動度に影響を生じることや、複合体が大きな不溶性凝集体を形成する可能性があります。解決策は、超音波処理装置を使用して核酸を分解することです。これにより、核酸は完全なタンパク質結合ドメインを形成できなくなります。

3. 切離したサンプルから脂肪組織をできる限り除去

核酸と同様に、脂質はタンパク質に結合し、WB時に問題を引き起こすことがあります。切離後も脂肪組織が残っている場合は、シリカカラムを使用して脂質を吸着させることを推奨します。

4. 生理的塩(イオン)濃度の維持

塩濃度が高いと、スマイリーバンドを生じる可能性があります。さらに、複数のレーン間の塩濃度が均一でない場合、同じタンパク質の移動がレーン間で異なる結果となる可能性があります。したがって、サンプル調製プロセスでは、全てのサンプルで生理的塩濃度を維持するようにします。

サンプルを分画または分離して、存在量が少ないタンパク質の濃度を上昇させる

一部のタンパク質は、特定の細胞または細胞小器官にのみ存在します。その結果、ライセート全体を使用した場合、その存在量がWBの検出限界に達しない可能性があります。このような場合は、必要な細胞サブセットまたは特定の細胞小器官を、文献に従って分画することを推奨します。

濃度の平準化と評価

タンパク質抽出が完了した後、サンプル中のタンパク質濃度を決定することが重要です。BCAなどの定量的タンパク質アッセイは、最も正確な結果が得られます。また、SDS-PAGEを実施してライセートの品質を評価し、溶解が完全であり、分解が起こっていないことを確認することを推奨します。

一定したサンプルローディングを確実にするには、すべてのサンプル間で一定となるように濃度を調整する必要があります。これが完了したら、4Xローディングバッファーをサンプルに添加します。

タンパク質抽出をエラーなく行い、濃度の揃ったサンプルを確実に得るための様々な方法を実施したうえでも、実験にはローディングコントロールを含めることを強く推奨します。

Blog

Posted:
3 November, 2016

Share:


Back
to top