細胞内フローサイトメトリー染色プロトコル

フローサイトメトリーの細胞内染色における異なるアプローチについて、固定と透過のための”do-it-yourself”ガイドで理解を深めましょう。

フローサイトメトリーは、関連する同定マーカーを測定するために、抗体を用いて、不均一な集団中の細胞群を同定するために用いられる強力な技術です。細胞外タンパク質の検出は、生きた細胞で行うことができますが、細胞内タンパク質を検出するためには異なる段階をとる必要があります。まず、細胞内タンパク質を固定するためには、細胞内タンパク質が透過後に拡散できなくなるように固定が行われなければなりません。次に、抗体が細胞内の標的に到達できるように、細胞膜を透過させる必要があります。

固定および透過の方法は、コロキアルに「固定および透過」として知られている、多くの異なる方法があり、これには、あらかじめ製造された緩衝液およびわかりやすい説明が付いた一般的な市販キットが含まれます。しかし、固定と透過は、広く入手可能な試薬を使用して簡単に実行できるため、ユーザーは、コストを節約して、必要に応じて緩衝液組成を微調整できます。特定の組織サンプルおよび細胞タイプは、特定の試薬でよりよく機能し、細胞内外の抗原の中には、最良の結果を得るために異なる方法を必要とする場合があることに注意してください。したがって、抗体メーカーのプロトコルや提案に従うことが推奨されます。

固定および透過ステップを行う前に、まず、(組織ホモジネートまたは細胞株から)サンプルを調製して、単一細胞懸濁液を生成し、フローサイトメトリーの完全なガイドを参照してください。固定、透過および染色のステップは、個々のフローチューブのいずれかで行うことができ、または、固定および透過は、その後の染色のためのアリコートの前に、大きなバッチで行うことができます。使用される最も一般的な固定液は、4%パラホルムアルデヒド(PFA)であり、他の一般的な試薬には、有機溶媒のメタノール、アセトンまたはエタノールがあります。場合によっては、他の固定剤(例えば、PMID:24735454)によって破壊されたエピトープを保存できるため、亜鉛ベースの固定剤が使用されます。固定ステップは、理想的には氷冷溶液(固定プロセスは発熱性)で行い、固定液がすべての細胞に最大限に浸透するようにサンプルを穏やかに渦巻き込む(細胞凝集を避けます)ように行うべきです。 タンパク質の過剰なクロスリンク(自家蛍光の増加)を回避し、非特異的ターゲットに対する固定剤のクロスリンク抗体の残りを防ぐため、固定手順の後に固定液を完全に洗い流してください。

一旦固定されると、細胞は、サンプルタイプおよび所望の標的のための適切な試薬で透過することができます。ほとんどの場合、メタノールは透過に適しており、サイトゾル、細胞小器官、核の標的に接近するのに十分な強さです。もしメタノールが実験の必要条件に不適当ならば、架橋固定に続いて、Triton Xのような強力な界面活性剤を用いることができます。サポニンは、ある種のエピトープの天然構造をよりよく保存することができる、それほど厳しくない界面活性剤ですが、細胞小器官や核膜を透過させるほど強力ではないため、抗体の接近を減少させる可能性があります。一旦細胞が固定され、透過すると、その後の抗体染色ステップを実行できます。

PFAのような架橋固定剤は、これらの標的の検出不良を引き起こし得るアルコール固定と比較して、リン酸化などの翻訳後修飾を保存するため、細胞内シグナル伝達の研究に適していることがよくあります。しかしながら、ホスホ-STATタンパク質のようないくつかの標的は、従来のアルデヒド-界面活性剤の固定および透過を使用しても検出できません。これらの場合、氷冷メタノールを用いて、このようなエピトープを「露出させる」こともできます(PMID: 16080188参照)。抗体の検証プロセスで最も適した組み合わせが決定されるため、まずは、その抗体とその標的に最適な固定剤と透過化試薬の製造ガイドラインに従うことが推奨されます。フローのための抗体を選択する際には、どの固定剤及び透過化試薬が社内検証に使用されたかを明確に記載している製造業者を探してください。 Proteintech社では、製品固有のプロトコールで使用した特定の試薬に焦点を当てています。

図1. 抗体が細胞内標的に接近するための異なる固定法と透過法の模式図。

 

細胞内外の標的の染色

多くの場合、特異的なリサーチクエスチョンに答えるために、細胞表面タンパク質と細胞質タンパク質をフロー抗体パネルで同時に染色する必要があります。抗体パネルの各メンバーで機能する試薬の組み合わせが1つではない可能性があるため、注意深い計画が必要です。 例えば、細胞表現型決定CD-マーカー抗体は、未固定の生細胞で使用するために開発されており、これらのいくつかは、固定および透過プロトコールでは十分に機能しません。細胞内抗体を用いた固定および透過プロトコールで細胞表面マーカーを使用する前に、メーカーの推奨事項を確認してください。この情報が入手できない場合は、試行実験を行い、提案された固定および透過条件に対する抗体の適合性を確認します。これを行うには、生細胞のアリコートの2つのチューブを設定します。1つは細胞表面マーカー抗体インキュベーション前に提案されている固定および透過プロトコールを通過させ、1つは生細胞を固定および透過無しで細胞表面マーカー抗体と直接インキュベートさせます。次のサイトメトリー分析で、固定および透過処理されたアリコートにおける陽性および陰性集団に明確な区別がある場合、細胞内および細胞外マーカー抗体の主な実験を一緒にインキュベートすることができます。

固定とパーマを行っても細胞外表面マーカーが機能しない場合は、メタノールの代わりにサポニンのような別の透過試薬を試す価値があります。あるいは、最初の生細胞を使用して、細胞表面マーカー抗体をインキュベートし、続いてその後の固定および透過および細胞内抗体染色ステップを行う、連続的な染色ステップを実行することができます。連続的なステッププロトコールを用いることにより、多くの場合、最良の結果が得られますが、細胞表面マーカー抗体のフルオロフォアが透過試薬と適合しているかを確認することが重要です。APCやPEのようなタンパク質ベースのフルオロフォアは、メタノール透過後に変性するため、その蛍光特性が阻害されます。

 

固定および透過プロトコル

以下は、DIYと固定および修正のプロトコルに従う例であり、正確な詳細は、サンプルの種類および利用可能な機器によって異なります:

1. 4%PFA固定プロトコル

単一細胞懸濁液には個々の試験官あたり1×106個の細胞が含まれているため、目的のサンプルを準備します。必要に応じて、固定前に細胞表面抗原染色ステップを実施します。

1.1 x1PBSで細胞を洗浄し、遠心分離によって細胞をペレット化します(通常、200〜300gで約2〜5分で十分です)。上清を廃棄します。

1.2 4%PFA(氷冷)を試験管当たり~100μl加え、穏やかに渦を巻き、ペレットが確実に分離するようにします。室温で20分間インキュベートします。

1.3 x1PBSおよびペレット細胞を加えます(ステップ1.1に従って)。上清をPFA廃棄物容器に取り除きます。

1.4 適切な透過処理ステップに進むか、x1PBSに再懸濁して4℃で一晩保存します。

2. メタノール透過プロトコル

メタノールは、タンパク質を基にしたフルオロフォアを変性させることに注意してください。透過前にこれらを添加しないでください。

2.1 PBSを除去し(必要に応じて一晩保存した後)、約100μlの90%氷冷メタノールを加え、穏やかに渦巻きます。細胞サンプルは、あらかじめ冷却する必要があります。

2.2 氷上で15分間インキュベートします。

2.3 x1PBSで洗浄し、エタノールを除去します(ステップ1.1と同様)。

2.4 標準的なプロトコールに従って、その後の免疫染色段階を進めます。

3. Triton X-100透過プロトコル

希望する抗体緩衝液に0.1~0.3%のTriton™X-100を含むように、必要な細胞透過緩衝液を調製します。抗体緩衝液の例は、1xPBS中の0.5%BSAです。

3.1 固定後、ステップ1.3を進めます。

3.2 約100μlの細胞透過緩衝液に再懸濁します。

3.3 室温で10分間インキュベートします。

3.4 (ステップ1.1に従って)透過性緩衝液を除去するために、x1PBS中で洗浄します。

3.5 標準的なプロトコールに従って、その後の免疫染色段階を進めます。

4. サポニン透過化プロトコル

一部の抗原は、メタノールやTriton X-100などのより強力な透過薬とは適合しません。この場合、より穏やかな界面活性剤サポニンを用いることができます。サポニン透過化は可逆的であり、透過処理後の洗浄および抗体インキュベーション緩衝液にサポニンを含めるようにしてください。 細胞透過/洗浄緩衝液を0.1%サポニンとして、0.5%BSAをx1PBS中で調製します。

4.1 固定後、ステップ1.3を進めます。

4.2 約100μlの細胞透過緩衝液に再懸濁します。

4.3 室温で10分間インキュベートします。

4.4 上記の透過/洗浄緩衝液を用いて、その後の免疫染色段階を進めます

5. 未固定のサポニン透過化プロトコル

場合によっては、PFAのような固定剤は、細胞内抗原を変性させることができます。これらの場合、もし光散乱測定が重要でなければ(たとえば細胞株で)、固定されていない細胞は、サポニンの存在下で細胞内抗原を染色することができます。この方法は、たとえばヨウ化プロピジウムを用いてDNA量を測定するのにもよい方法です。

5.1 1x PBSでチューブあたり1x106細胞の単一細胞懸濁液を洗浄してペレット化します。

5.2 1x PBS中に0.3%サポニン1mlを加え、細胞ペレットに一次抗体を結合させます。

5.3 穏やかに混和し、4℃で30分間インキュベートします。

5.4 上澄液をスピンダウンして廃棄し、0.1%サポニンおよびPBSで洗い、再度スピンダウンしてください。

5.5 任意:0.3%サポニンx1PBS1~2mLにヨウ化プロピジウム10μg/mLを加えます。4℃で10分間インキュベートします。

5.6 可及的速やかにフローサイトメーターで分析します。

概要

以下は、一般的な固定法と透過法のさまざまな使い方とヒントをまとめた表です。

 

メタノール

Triton-X

サポニン

未固定のサポニン

使用法:

ほとんどの細胞内標的にアクセス

スタンドアロンの固定・透過として使用可能

DNA解析に適している

ホスホマーカーに良好

ほとんどの細胞内標的にアクセス

氷冷PFA固定後に使用

タンパク質ベースのフルオロフォアに良好

ほとんどの細胞内標的にアクセス

核染色には必ずしも適さない

メタノールが標的エピトープに損傷を与える場合、代替法として良好

氷冷PFA固定後に使用

固定が細胞内抗原を変性させる場合は代替となる

DNA量測定時に良好

ヒント:

タンパク質ベースのフルオロフォアを変性させる。

メタノールが氷冷していることを確認。

特定のクローニング/標的は、異なる透過メカニズムの方がよい。

サポニン透過は可逆的。プロトコル中に後続のすべての緩衝液で使用。

光散乱測定に影響を与える可能性がある。

 

詳しいリソース

詳しいリソースについては、KrutzikとNolan,2003Cytometry Part APMID: 14505311)による、リン酸化タンパク質標的の異なる固定法と透過法の比較に関するこの高引用度論文をご覧ください。一般的なフローサイトメトリーに関する詳しい情報を探している場合は、Cossarizza et al. 2019 Eur J ImmunologyPMID: 31633216)による詳細なレビューをご覧ください。

Blog

Posted:
15 December, 2020

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