自家蛍光を減らす方法

自家蛍光の原因と対処法について解説します。

免疫蛍光(IF)は、一般的な抗体ベースの手法であり、組織や細胞内のタンパク質の発現や分布を解析するために使用されます。従来の発色性染色と比較してIFを使用する利点の一つは、同じスライド上で複数のターゲットを観察するために、別々の蛍光体の異なる発光スペクトルを利用することにより、多重染色が容易であることです。また、IFは、比較的高感度で広いダイナミックレンジを持つことから、高発現タンパク質と並んで低発現タンパク質の観察や、タンパク質-タンパク質の共局在を観察することができます。しかし、IFの1つのアーチファクトは、特定のサンプル内での自家蛍光の存在であり、これはしばしば、低発現の標的または薄暗い色素の発現をマスクしてしまう場合があります。残念ながら、これにより、スライドのノイズから特定の染色を識別することは困難になります。

自家蛍光とは?

自家蛍光は、抗原-抗体-蛍光体相互作用の特異的な染色に起因しない、組織内のバックグランド蛍光であると説明されています。これにはいくつかの原因があり、実験においてその影響を最小限に抑えるためのステップがあります。

クロスリンク固定化による自家蛍光

組織固定のための一般的な方法は、ホルマリンなどの化学的クロスリンク試薬を使用することです。これらの固定剤は、タンパク質同士を結合させる共有結合を作り、組織構造を維持する不溶性の網目を形成することで作用します。アルデヒド固定化の不幸な結果は、アルデヒドとアミンが結合してシッフ塩基を形成し、その結果、自家蛍光が生じることです(グルタルアルデヒド>パラホルムアルデヒド>ホルムアルデヒド、PMID:6404984)。

このような固定による自家蛍光は、広い発光スペクトルを持ち、青、緑、赤のスペクトル領域で発光を示します(PMID:24722432)。また、サンプルの熱や脱水によっても自家蛍光が増加することがあり、その効果は赤色スペクトルでのほうが大きいです。 自家蛍光を最小化する最良の方法は、必要最小限の時間でサンプルを固定することです。また、これを最小限に抑えるために、水素化ホウ素ナトリウムによる処理も行われています(PMID:9765122)が、その変動効果のためにあまり推奨されていません。別の方法として、他の固定剤が利用可能です。例えば、細胞には良好な固定剤である冷蔵(-20℃)エタノールのような有機溶媒を使用することができます。

図1. 緑(左)と遠赤(右)のフィルターを使用して撮影した、染色されていないホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)腎臓組織の内在性自家蛍光。遠赤色フィルターの下では、バックグランドの自家蛍光がかなり目立たなくなっていることに注目いただきたい。

内在性色素の自家蛍光

自家蛍光は、組織内の天然化合物が原因で発生することもあります。赤血球中のヘム基は、ポリフィリン環構造を持つために広い範囲で自家蛍光を示し、解析を複雑にする可能性があります(PMID:29058770)。これを最小限に抑える最良の方法は、固定前にPBSで灌流することです。しかし、死後や胚組織のようないくつかの組織サンプルでは、PBS灌流が必ずしも可能であるとは限りません。いくつかのケースでは、低pHでCuSO4およびNH4CLで処理することによって、またはH2O2で組織をブリーチすることによって、自家蛍光が低減することが認められています。

その他の問題のある内在性色素としては、コラーゲン、NADH、リポフスチンなどがあります。コラーゲンは、ユビキタス構造を持つ高発現タンパク質で、300~450nm付近の青色領域に発光スペクトルを有しています(PMID:11830520)。NADHは代謝に多くの役割を果たすために欠かせない酵素であり、肝臓などの代謝が活発な細胞や組織ではその量が増加します。NADHは450nm付近の発光スペクトルを持っています(PMID:11830520)。したがって、コラーゲンやNADH(青/緑のスペクトルで発光する)などの化合物を高濃度に含む組織を染色する場合、CoraLite594CoraLite647のような赤色および遠赤色領域の発光スペクトルを持つ蛍光体を選択することで、特異的な染色を自家蛍光と区別するのに役立ちます。リポフスチンは粒状で親油性の色素であり、骨格筋、神経細胞、心臓など多くの組織のリソソームに、加齢とともに蓄積します。リポフスチンは、500~695nmで最も強く発生するスペクトルで蛍光を発し、その粒状の外観が特定の染色と間違われる可能性があるため、別の問題を生む化合物であることがあります。これらの効果を否定するには、親油性色素であるスーダンブラックBにより、この自家蛍光を効果的に除去することができます(PMID:10330448)。しかし、スーダンブラックBは遠赤色チャンネルで蛍光を発するため、多重染色パネルを計画する際には考慮しなければなりません。

自家蛍光トラブルシューティングのまとめ

自家蛍光が実験で問題になっている場合、これらの一般的な重要ポイントを押さえることで、うまくいけば、いくつかの問題を解決し、不要な「光を抑え」つつ重要な点に光を当てることができるかもしれません。

  • 可能であれば、クロスリンク固定剤の代替品を使用するか、もしくはグルタルアルデヒドに代わりパラホルムアルデヒドを試してみてください。そして、固定時間は常に必要最低限にしましょう。
  • 水酸化ホウ素ナトリウムは、ホルマリン誘導自家蛍光を減少させるために使用できます(まちまちな結果が出ています)。
  • 赤血球の存在を除去するために、固定前にPBSで組織を灌流します。
  • スーダンブラックBやエリオクロムブラックTなどの化合物は、リポフスチンやホルマリン誘導自家蛍光を減少させます。
  • サンプルの自家蛍光化合物が発光するよりも高い波長で発光する蛍光体を使用します。一般的には、CoralLite 647のような遠赤色波長の蛍光体が最適です。
  • TrueVIEW(VectorLabs)のような市販の試薬は、複数の原因から自家蛍光を減少させることが示されています。
  • 免疫蛍光実験における自家蛍光と非特異的結合のレベルを明らかにするために、必ず内在性組織対照(一次抗体または二次抗体なし)と一次抗体対照(二次抗体のみ)を実行してください。
Blog

Posted:
17 August, 2020

Share:


Back
to top