ELISA実験を最適化する方法

より良いELISAの結果を得るための技術的ヒント

ELISA入門

ELISAキットでのマッチド抗体ペア(Matched antibody pair

ELISAサンプル

ELISAのブロッキングおよび洗浄ステップ

ELISA実験を最適化する方法

一般的なELISAの問題

ELISA入門

酵素結合性免疫吸着検定法(ELISA)は、現在利用可能な最も感度・再現性の高い技術の1つです。これらのアッセイは迅速で、実施が簡単であり、容易に自動化できます。他のアッセイと同様に、ELISAの再現性および信頼性は、適切な技術と細部への注意に依存します。

ELISAの技法は下記のように分類されます:

直接ELISA:抗原がELISAプレート上に固定されており、一次抗体に標識が付いています(図1 A)

  • 間接ELISA:抗原がELISAプレート上に固定されており、二次抗体に標識が付いています(図1 B)
  • サンドイッチELISA:2つの一次抗体(捕捉用および検出用)が抗原を挟んで「サンドイッチ」を形成し、次にこの複合体が、標識の付いた二次抗体により認識されます(図1 C)。

図1. ELISAフォーマットの種類:A)直接ELISA、B)間接ELISA、およびC)サンドイッチELISA.

ELISAキットでのマッチド抗体ペア(Matched antibody pair)

マッチドペアとは、同じタンパク質抗原上の異なるエピトープを認識することが知られている抗体のセットを指します。そのため、マッチドペアは、サンドイッチELISAにおいて単一の抗原を捕捉および検出するのに一緒に使用することができます。ELISAアッセイで使用される抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または両方の組み合わせである場合があります。

モノクローナル抗体は、ELISAのすべての種類において抗体を含むすべてのステップに使用できます。モノクローナル抗体は、サンドイッチELISA法におけるマッチドペアとしてセットで一般的に使用されますが、ポリクローナル抗体と組み合わせて捕捉または検出に使用して、シグナルを強化したり、複雑な溶液から抗原が捕捉される可能性を高めたりすることが可能です。

ポリクローナル抗体溶液中に存在する抗体の不均一性と、存在するエピトープに幅広く反応することから、ポリクローナル抗体は抗原を検出するための強力なツールとなり、高頻度でモノクローナル抗体よりも高いレベルのシグナルをもたらします。しかし、ポリクローナル抗体は、1つ以上のエピトープを関連するタンパク質と共有する可能性が高く、その結果、非特異的なシグナルが高くなります。この問題を軽減する1つの方法は、アフィニティー精製したポリクローナル抗体または交差吸収処理されたポリクローナル抗体を使用することです。アッセイの感度を上げるために、ELISAの検出方法を、ポリクローナル抗体を使用して直接検出から間接検出に切り替えることができます。

 

ELISAサンプル

ELISAでは、様々なサンプル(検体)を試験することができます。アッセイ条件の選択は、検体の複雑さと、予測される抗原の存在量によって異なります。

結果の正確性の確保および定量化のために、既知の標準と組み合わせて、すべての検体を2反復または3反復で試験することが重要です。

検体を複数の希釈度で試験して、最終結果が標準曲線の線形部分の範囲内に収まることを確認する方が良いでしょう。高濃度の検体は濃度を過小に評価する可能性があり、高希釈の検体は濃度を過大に評価する可能性があります。

 

ELISAのブロッキングおよび洗浄ステップ

ブロッキングは、多くの場合、検出抗体がマルチウエルプレートの表面自体に非特異的に結合するのを防ぐために必要となります。プレートが完全にブロックされると、非特異的なシグナルが減少するため、アッセイの感度は向上します。

信頼性の高いELISAの結果を得るには、徹底的な洗浄手順が不可欠です。吸引用チップをゆっくりと底まで下げて、すべてのウェルから液体を完全に吸引することが重要です。なお、ウェルの内側をこすらないでください。洗浄が完了したら、プレートを裏返し、吸収性ティッシュ上で乾燥させることを推奨します。

 

ELISA実験を最適化する方法

各構成要素トを別々に説明しましたが、多くの事例において、チェッカーボード力価測定を実施することにより、2つの要素を同時に最適化することができます。

1)     キャプチャー抗体の濃度

  • コーティングバッファーで異なる濃度のキャプチャー抗体を調製します。

2)     ブロッキングバッファー

  • 複数のブロッキング溶液を調製します。ブロッキング溶液が事前に調製されていない場合(すなわち、タンパク質単体、例えば溶解前BSAとして存在している)、そのタンパク質を異なる濃度で試します。

3)     スタンダード用希釈液

  • スタンダード(標準)用希釈液は、検体のマトリックスに極力近いものとします。
  • マトリックス自体を正確に複製できない場合は、複数の標準用希釈液を試験し、スタンダードカーブ(標準曲線)と検体の希釈の直線性を確認します。別の希釈液を選択する必要があることがあります。
  • 検体の直線性が低い場合、検体のマトリックスとスタンダード用希釈液とのバランスが崩れている可能性があります。このような場合、添加回収実験または希釈直線性実験を実施する必要があります。

4)    検体濃度

  • 基質の検出限界を念頭に置いて、様々な濃度の検体を調製します。生物学的サンプルマトリックスがシグナルをマスキングまたは増強していないことを確認するため、添加回収実験および希釈直線性実験を実施する必要があります。

5)      検出抗体濃度

  • 様々な濃度の検出抗体を調製します。

6)     酵素結合体濃度

  • 様々な濃度の検出抗体を調製します。

7)     シグナル検出

  • 検体中の抗原の量およびプレートリーダーによる検出能力に基づいて基質を選択します。
  • 抗原が明確に検出できれば、その基質は適切です。
  • 抗原が検出の閾値を下回っている場合は、より感度の高い基質を選択します。

 

一般的なELISAの問題

1)     ELISAにおいてシグナルが弱い、またはシグナルがない

  • アッセイを開始する前に、すべての試薬を15~20分間室温で放置することを推奨します。
  • 構成品の不適切な保管。キットのラベル上の保管条件を再確認してください。ほとんどのキットは2~8℃で保管する必要があります。
  • 試薬の不適切な添加/調製。プロトコールをチェックし、試薬が適切な順序で添加されていることと、正しい希釈に調製されていることを確認します。
  • 蛍光試薬の過剰露光。強い光は、フルオロフォア(蛍光体)の分解による光退色の原因となることがあります。光からのフルオロフォアの保護は、アッセイの最後に効果的なシグナルを生成するために不可欠です。
  • 構成要素のさらなる最適化が必要。アッセイの構成要素の1つが限界濃度にあるために、全体的なシグナルが低下している可能性があります。
  • 試薬の劣化。試薬の1つが劣化または汚染されている可能性があります。その場合は、交換する必要があります。
  • 抗体が非効率的な組み合わせで用いられているか、ターゲットに対する親和性が不十分。使用している抗体は、抗原に効果的に結合しないか、または互いに組み合わせると機能しない可能性があります。このような場合、代替抗体を試験する必要があります。
  • 検出システムのさらなる最適化が必要。検出システム(基質)が、シグナルを得るのに十分な感度がないか、標準曲線が検体に適していない可能性があります。検体の濃縮、またはより高感度の基質への切り替えが必要な可能性があります。

2)   高いバックグラウンド

  • 不十分な洗浄またはブロッキング。高いバックグラウンドシグナルは、一般に、不十分な洗浄またはブロッキング、検体成分または抗体のブロッキングバッファーとの交差反応、または過剰な酵素結合体を使用した結果です。
  • 特異的シグナルを与える酵素量と、バックグラウンドシグナルをだす酵素量のバランスをとることが重要です。これを制御する最も効果的な方法は、酵素結合体、抗体、およびブロッキング溶液を最適化することです。

3)      標準曲線の直線性不良

  • 標準曲線の直線性が低い場合、結果が正確であると見なされるには、検体が狭い濃度範囲に収まる必要があります。
  • 曲線の直線性は良好だが、複製間のばらつきが不良の場合(つまり、標準誤差)、検体間または個々のユーザー間でピペッティングの一貫性がないなど、技術的な問題がある可能性があります。

すべての検体および標準は、少なくとも2反復または3反復で測定し、この問題を軽減する必要があります。

4)   ELISAにおける過剰に高いシグナル

  • 不十分な洗浄。この問題を回避するには、適切な洗浄手順を使用します。たとえば、各洗浄ステップの最後に、プ​​レートを吸収性ティッシュ上に裏返し、完全に排液し、必要に応じて強くたたいて残留液を除去します。
  • インキュベーション時間が長すぎる。インキュベーション時間が過剰に長いことも、ELISAシグナルが過度に高い理由となります。推奨されるインキュベーション時間に必ず従ってください。
  • 汚染。プレートシーラーを使用してこの問題を回避し、プレートを開くたびに新しいシーラーを使用してください。これにより、ウェルが互いに汚染するのを防ぐことができます。

     

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Posted:
31 May, 2017

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