CRISPR-CAS9、TALEN、ZFN - 遺伝子編集における闘い

革新的な生物学的研究を行うためには、技術の進歩が不可欠です。ZFN、TALEN、CRISPR/CRISPR-associated Casはゲノム編集に革命をもたらしました。


DNAゲノム編集について一言

ゲノム編集は、特定のゲノム部位におけるDNA内容の恒久的な改変と理解されています。これまでは、長い相同アームを持つDNAテンプレートを目的のゲノム部位に送達することで行われていました。ゲノムへの組込みは、宿主ヌクレアーゼが相同DNAテンプレートを用いてDNA切断を修復する相同組換えプロセスに基づいていました。修復テンプレートには選択マーカーも含まれていたため、抗生物質の選択は、所望の変異を有するゲノム改変された細胞を検出するために使用されました。

このプロセスは時間がかかり、合成と長いDNAテンプレートの送達が必要でした。多くの哺乳類細胞型において効率的ではなく、選択後にゲノムに組み込まれた選択カセットを除去することを含む複数のステップが必要でした。現在では、ZFN、TALEN、およびCRISPR-Cas9の3種類の異なる編集ヌクレアーゼを利用できます。

ゲノム編集におけるヌクレアーゼの時代

ゲノム工学の真のブレークスルーは、標的DNAを特異的に認識して切断することができるヌクレアーゼの設計によってもたらされました(表1)。

- 最初のエンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)でした。 これらは、自然に発生する転写因子ファミリーであるジンクフィンガータンパク質に基づいており、これがエンドヌクレアーゼFokIに融合したものです1

ジンクフィンガードメインは、トリヌクレオチドDNA配列を認識することができます。したがって、一連の連結したジンクフィンガードメインは、より長いDNA配列を認識し、所望の標的特異性を提供することができるのです。しかしながら、アレイ内に配列されたジンクフィンガーモチーフは、隣接するジンクフィンガーの特異性に影響を与えるため、改変されたジンクフィンガーアレイの設計および選択はより困難であり、より多くの時間を要するものとなっています。最終的な配置の特異性を予測するのは困難です。 FokIエンドヌクレアーゼは、二量体として機能し、2つのZFNが対向のDNA鎖に結合している部位でのみ二本鎖DNA切断が発生することを意味します(図1A)。このシステムは、標的部位内に密接に位置する異なるヌクレオチド配列を認識するように設計された2つのZFNをベースにしており、両方のZFNの同時認識と結合を必要とするため、当然ながらオフターゲット効果が制限されます。

- 転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)は、細菌のTALEタンパク質とFokIエンドヌクレアーゼから成る融合タンパク質です2

ZFNと同様に、標的特異性は、タンパク質とDNAの会合に由来します。TALENの場合、単一のTALEモチーフが1つのヌクレオチドを認識し、TALEのアレイは、より長い配列と会合することができます(図1B)。各TALEドメインの活性は、1つのヌクレオチドのみに制限され、隣接するTALEの結合特異性に影響を与えないため、TALENの工学技術は、ZFNよりもはるかに簡単になっています。ZFNと同様に、TALEモチーフは、FokIエンドヌクレアーゼと結合しており、切断が起こるためには二量化を必要とします。つまり、標的DNAに近接した対向鎖での2つの異なるTALENの結合が必要ということです。

- CRISPR-Cas9(clustered regular interspaced short palindromic repeats;クリスパー)システムは、細菌の免疫システムに基づいています。

CRISPR-Cas9は、Cas9ヌクレアーゼと2種類のRNA―トランス活性化型crRNA(tracrRNA)とシングルガイドRNA(sgRNA)―で構成されており、標準的なワトソン-クリック塩基対を用いて標的配列を認識します。これは、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と呼ばれるDNAモチーフの次に位置しなければなりません。各Cas9タンパク質は、特定のPAM配列3,4を有しており、例えば、標準的なCas9では5'-NGG-3'です。DNAの切断はCas9ヌクレアーゼによって行われ、野生型酵素の場合は二本鎖切断を、ニッカーゼと呼ばれる変異型Cas9変異体を使用した場合は、一本鎖切断を引き起こすことができます(図1C)。CRISPR-Cas9システムにおけるDNA部位の認識は、RNA-DNA相互作用によって制御されています。これは、任意のゲノム標的に対する設計の容易さ、オフターゲット部位に関する予測の容易さ、複数のゲノム部位を同時に改変する可能性(多重化)など、ZFNやTALENと比較して多くの利点を提供しています。

特徴 ZFNs TALENs CRISPR-Cas9
認知されるDNAターゲットの長さ 9–18 bp 30–40 bp 22 bp + PAM配列
標的DNA認識のメカニズム DNA-タンパク質相互作用 DNA-タンパク質相互作用 ワトソン-クリック塩基対によるDNA-RNA相互作用
DNA切断の修復のメカニズム FokIにより誘起される二重鎖切断 FokIにより誘起される二重鎖切断 Cas9により誘起される一本鎖または二本鎖切断
設計 困難。予め定義された標的特異性を有するジンクフィンガーモチーフのライブラリが利用可能であるが、アレイで組み立てられたジンクフィンガーモチーフは、隣接するジンクフィンガーモチーフの特異性に影響を与える可能性があり、設計を困難にしている。 簡単。標的特異性を有するTALEモチーフが良好に定義されている。 簡単。標的DNAとの相補性に基づいたSgRNAの設計。
クローニング ジンクフィンガーモチーフ間の工学的な結合を必要する。 TALEは、結合を必要としない。別々のTALEモチーフのクローニングは、ゴールデンゲートアセンブリを使用して行うことができる5 Cas9の発現ベクターが利用可能。SgRNAは、DNA発現ベクターとして、または直接的にRNA分子またはプレロードされたCas9-RNA複合体として、細胞に送達することができる。

表1.よく使用されている編集ヌクレアーゼの標的特異性、作用機序、および実験デザイン。

図1.ヌクレアーゼの編集。A. ZFN - 2つの個別のZFNは、対向のDNA鎖の特定部位を認識して結合する。組み立てられたFokI二量体は、標的DNAを特異的に切断する。B. TALEN - 2つの個別のTALENは、対向のDNA鎖の特定部位を認識して結合する。組み立てられたFokI二量体は、標的DNAを特異的に切断する。C. CRISPR-Cas9システムでは、ゲノムDNAとsgRNAとの塩基相補性によりDNA部位が認識され、tracrRNAと会合して、Cas9ヌクレアーゼにロードされてDNA切断を行う。


オフターゲット効果の低減

オフターゲット効果を低減するような方法でヌクレアーゼを設計することは、基礎科学的なアプローチだけでなく、臨床や産業的な利用を想定した場合にも大きな課題でした。

in vivoまたはin vitroのいずれかにおいても、ZFNおよびTALENの送達は、オフターゲット部位での結合および望まないDNA切断の誘導により、毒性または致死性につながる可能性があります。ZFNとTALENにおけるFokIの変異は、2つの個別のヌクレアーゼにより結合された部位でのヘテロ二量化イベントの際にのみ、FokIエンドヌクレアーゼ活性を促進するよう導入されました6,7。CRISPR-Cas9システムのオフターゲット切断は、ほとんどの場合、sgRNAによる完全または部分的に相補的なゲノム部位の認識に由来します8。選択的送達法あるいはCas9半減期時間の変更によって、細胞内での活性Cas9タンパク質の量と時間を制限するなど、オフターゲット切断を制限するための様々なアプローチが提案されています9。オフターゲット特異性の低い種々のCas9変異体が開発されており、HF-Cas9、eCas9、およびHypaCas9などがあります10-12。CRISPR-Cas12(Cpf1)やCRISPR-Cas13a(C2c2)のようなCas9およびCas9相同体の新しい変異体は、異なるPAMを認識することができ、精密なゲノム編集の選択肢を大幅に増加させるだけでなく、より高い標的特異性を備える可能性があります13。興味深い代替案は、ZFN/TALENとCRISPR-Cas9システムの利点を兼ね備えた、FokIヌクレアーゼとCas9の融合体です13,14

新しい研究ツールとしてのCas9キメラ - DNA切断に留まらないもの

最近では、機能喪失研究および機能獲得研究などにおいて、様々なCas9キメラが開発されています15。Cas9の存在は、ゲノムターゲティングを可能にする一方、融合した付加的なタンパク質は、Cas9活性を調節することができます。

「CRISPR干渉」(CRISPRi)では、抑制的なKRABエフェクタードメインにCas9タンパク質を融合させることで、転写抑制による遺伝子発現をダウンレギュレーションできます16。このアプローチは、標準的なRNA干渉(RNAi)技術よりも優位性があり、タンパク質をコードしない遺伝子の機能を調べることができます。さらに、逆のアプローチ(CRISPR活性;CRISPRa)が可能です。転写活性化ドメイン(VP64など)とのCas9融合は、所望のゲノム座の発現増加をもたらします。転写のさらなる活性化は、相乗的活性化メディエーター(SAM)を用いて達成でき、これは、Cas9融合体が複数の活性化ドメインを含んでいるため、活性化効率を最大化することができます17。Cas9キメラの中には、ヌクレアーゼ活性を持たないものもあります。例えば、Cas9とクロマチン修飾酵素との融合体は、タンパク質とDNAの結合部位を可視化するための研究やクロマチン構造を調べるための研究などのエピゲノム研究、あるいは、ヒストンの翻訳後修飾研究などに利用されています<18,19

CRISPR-Cas9と細胞株の遺伝子編集のイノベーション

CRISPR-Cas9は、ヒトゲノムの有害な遺伝子変異を逆転させるために利用することができます。このアプローチでは、野生型配列を含む修復DNAテンプレートとともに、Cas9タンパク質、tracrRNAおよび部位特異的sgRNAを必要とします。Cas9は、部位特異的なDNA切断を生じさせ、次いで、この切断部位が宿主のDNA修復機構によって修復されて、野生型対立遺伝子が回復されます(図2A)。

CRISPR-Cas9は、細胞株工学においても信頼できるツールとして役に立ちます。このアプローチは、Cas9タンパク質、tracrRNA、および部位特異的sgRNAの送達を必要とします。Cas9は、宿主のDNA修復機構によって修復される部位特異的なDNA切断を作成します。修復テンプレートが存在しない場合は、トランケーションを招き得るヌル突然変異を引き起こす可能性があります。所望の変異を含む修復テンプレートを導入することにより、より標的を絞ったアプローチが可能です(図2B)。

図2.A)遺伝子治療およびB)細胞株工学におけるCRISPR-Cas9システムの利用。

今後の展開

ヌクレアーゼの編集は、ゲノム工学に革命をもたらし、哺乳類ゲノムの編集を容易にしました。これらは、基礎研究だけでなく、遺伝性疾患においてDNAに基づく疾患の原因となる突然変異を逆転させる可能性のあるメカニズムとして、前臨床研究や臨床研究でもよく用いられています。非商業的および商業的な技術革新が、わずか20年前に始まった継続的な技術開発を可能にしており、将来的には、科学や生物医学の発展のためにさらに広く利用されることになるでしょう。

投稿者:Karolina Szczesna博士、プロテインテック社シニアプロダクトマネージャー兼テクニカルサポート


参考文献

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Posted:
24 October, 2018

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