科学者のためのBCA、ブラッドフォード、およびUVタンパク質定量法の比較

BCA、ブラッドフォード、UV法の長所と短所について解説します。

サンプル中のタンパク質の量を測定することは、生物学的研究や医学的診断に不可欠です。例えば、薬剤を添加した後に特定のタンパク質の濃度が急激に上昇したり低下したりすることは、生体反応のメカニズムにおいて、重要な役割を果たしていることを示唆しています。ラボでは、ウエスタンブロッティングや蛍光体コンジュゲーションなどの化学反応を行うために、正確なタンパク質濃度が必要とされます。診療所では、ELISAなどの高感度な方法を用いて、COVID-19患者のインターロイキンなどのサイトカインを測定することが、重症度の予測に役立つ可能性があります(PMID:32283152)。

サンプルや試薬中のタンパク質の濃度を決定する方法はいくつかあります。それらの中でも、BCA法、ブラッドフォード法、紫外線(UV)法は、科学研究で最も広く使われている方法です。それぞれの方法は、異なる科学的原理に依拠しており、それぞれに長所と短所があります。私たちは、HumanKine®サイトカインや成長因子には、感度の高さと範囲の広さを評価してBCAを使用しています。抗体については、従来はブラッドフォード法を使用していましたが、感度の高さと必要サンプル量の少なさから、ナノドロップ分光光度計を用いたUV法に移行しました。

BCA法

BCA法は、BCA(ビシンコニン酸)、硫酸銅(Cu2+)、タンパク質との比色反応を利用しています。アルカリ性の条件下では、タンパク質のペプチド結合が2価の銅イオンを1価の銅イオンに還元します。一価の銅イオンはBCAによってキレートされ、安定な錯体を形成し、これが紫色の光を吸収して溶液を緑色から紫色に変えます。還元反応は、タンパク質濃度に比例するため、プレートリーダーまたは分光光度計による562nm(紫)での溶液の吸光度を利用してタンパク質濃度を算出することができます。

BCA法の長所:

  • 高感度

  • 広い検出範囲(20~2000ug/ml)

  • 簡便で迅速な(45分前後)プロトコル

  • 高価な装置を必要としない

BCA法の短所:

  • 反応は、還元剤およびキレート剤(例えば、EDTA)の影響を受ける。

ブラッドフォード法

ブラッドフォード法は、クマシーブリリアントブルー法としても知られていますが、これは、その発明者であるジョージア大学のMarion Bradfordにちなんで命名されました。クマシーブリリアントブルーは、トリフェニルメタン色素で、タンパク質と結合すると、カチオン性の未結合の赤色からアニオン性の青色に色が変化します。タンパク質が存在すると、赤色色素分子の負のスルホン基がリジンおよびアルギニンなどの正の側鎖に電子を供与します。これにより、タンパク質が不安定となり、ファンデルワールス相互作用を促進し、疎水性残基が色素に暴露されて、青色アニオン性の色素と安定な複合体を形成します。青色フォームの吸収ピークは595nmであり、この複合体の光学密度は、一定の範囲でタンパク質の含有量と線形関係を持っています。

ブラッドフォード法の長所:

  • ワンステップ、10分未満のアッセイ

  • 高価な装置を必要としない

ブラッド法の短所:

  • 相当量のサンプルを使用する。

  • 反応は、一般的なタンパク質界面活性剤(例えば、Triton X、SDS)の存在によって影響を受ける。

  • 塩基性アミノ酸の量が平均を上回る、または平均を下回るタンパク質には有用ではない。

**注:タンパク質濃度検出用のクマシーブリリアントブルーG250と、PAGEゲル染色用のクマシーブリリアントブルーR250は同じものではありません!G250は、タンパク質と素早く反応しますが、ゲルの染色が遅いため、タンパク質の定量に最適です。R250は、タンパク質と徐々に反応し、ゲルの染色が速く、溶出しやすいため、PAGEゲルの染色により適しています。

UV法(ナノドロップ)

UV法では、紫外線分光光度計を用いてタンパク質の濃度を推定します。 これは、タンパク質分子中の芳香族アミノ酸(トリプトファン、リジン、フェニルアラニンなど)が、紫外線を吸収できる共役二重結合を持っている点を利用しています(最大吸収ピークは波長280nm)。ビール・ランベールの法則に基づいて、紫外線吸収を利用して濃度を計算することができます。

UV法の長所:

  • 極めて感度が高い

  • 追加の試薬を必要としない

  • 少量のサンプルを使用

  • アッセイはタンパク質活性に影響を与えない

UV法の短所:

  • 核酸など、280nmで光を吸収する化合物との干渉がある。
  • 芳香族アミノ酸の量が平均を上回る、または平均を下回るサンプルを検査するためには、適切な基準タンパク質が必要。

タンパク質の濃度を決定するための完璧な解決策はないため、皆さんのサンプルに最適な検出方法を選択することが重要です。

参考文献:

1. Zhou Yuenan, Wang Zhan, etc. Talking about the quantitative detection method of protein content[J]. Food Research and Development, 2014.

2. Fan Shuangshuang, Li Zhengping. Comparison of several methods for detecting protein concentration[N]. Journal of Chengde Teachers College for Nationalities, 2004

3. Fan Huajie, Li Wenjie. Reasonable application of protein quantitative methods[J]. Chinese International Medical Journal, 2003

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Posted:
27 August, 2020

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