ヒントとコツ | ChIP実験を成功させるための7つのこと

ChIP実験でより良い結果を得るために、7つのポイントを解説します。


クロマチン免疫沈降(ChIP)の概要
  • ChIP(クロマチン免疫沈降、Chromatin  Immunoprecipitation)法は、生細胞内でDNAと相互作用する転写因子とクロマチン調節因子複合体の分析を可能にする強力な手法です。ChIPは、様々な機能状態において遺伝子に結合したネイティブクロマチン構造と因子の生細胞像を提供します。

  • ChIPの方法論には、タンパク質–DNA架橋(クロスリンク)が含まれます。

  • 単離された未精製のクロマチンは超音波処理され、通常300〜1000 bpの平均サイズの小さな断片が生成されます。

  • タンパク質特異的抗体を使用し、クロマチンの断片を免疫沈降します。

  • 免疫沈降物の分子分析を使用して、目的のタンパク質が、選択したDNA領域にin vivoで結合しているかどうかを明らかにします。

 

クロマチン構造が遺伝子発現の調節に決定的な役割を果たすというエビデンスが増えているという観点から、遺伝子調節の構造的側面と機能的側面を両方同時に研究する傾向が高まっています。以下は、ChIP実験の最適化に役立つ最も関連性の高いヒントの要約です。

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ChIPのヒント1: 常に細胞/組織を氷上に保管してください。

温度は極めて重要です。4°Cで細胞溶解を行ってください。サンプルを氷冷し、氷冷したバッファーを使用します。

ChIPのヒント2: 不十分/過剰な架橋

架橋時間とホルムアルデヒド濃度の両方が重要です。

以下の点に注意してください: パラホルムアルデヒドを使用するときは、必ず新たに調製されたものを使用してください(最終濃度1%〜1.5%)。

  • 架橋が不十分な場合、タンパク質DNA複合体の分離が妨げられ、収率が低下することがあります。

  • 過剰な架橋は、抗体結合に重要なエピトープ部位をマスクし、クロマチン剪断を妨げ、タンパク質-DNA複合体の正常な脱架橋を阻害することがあります。

ChIPのヒント3: クロマチン剪断および超音波処理

  • 組織懸濁液中の大きな断片は回避します。

  • カットチップ付きピペットはより良好な均質化に適しています。

  • ソニケーターのプローブがチューブの壁に接触していないことを確認します。

  • 超音波処理のステップ数を増やします。しかし、各ステップの時間(または出力)を増やすことは避けてください。サンプルが過熱し、抗原性の喪失につながる可能性があります。

  • ソニケーターに氷を加え、サンプルの過熱を防ぎます。

  • できれば、クロマチンを500 bp未満のフラグメントサイズまで超音波処理しないでください(サイズ検査ステップを実施します)。

  • 以下の点に注意してください:細胞の種類が異なれば、最適なDNA断片化も異なる可能性があります。DNA断片化が最適となる適切な超音波処理時間を決定してください。

  • サンプルを入れることを忘れないでください。

ChIPのヒント4: ビーズおよび一次抗体の選択

IP画分は、希釈および事前のChIP画分を表します。これは、目的抗体またはコントロール抗体が関与する免疫沈降ステップに使用されます。

ビーズに関する注記:

  • ピペッティングする前に、常にボルテックスによってビーズを完全に再懸濁します。

  • 常に4°Cで保管し、決してビーズが乾かないようにします。

  • 抗体のサブクラスがタンパク質A/Gと適合性があることを確認します。

抗体に関する注記:

目的の抗体がChIPで検証されていることを確認します。(抗体の特異性は、IP後にウエスタンブロットで確認することができます。)

  • 抗体の量が不十分な場合、PCR分析を成功させるのに十分な材料が得られないことがあります。

  • 抗体が多すぎると、PCRのバックグラウンドが高くなることがあります。

抗体によっては、溶解物とのインキュベーションを短時間室温で行うことが可能な場合があります。しかし、一般に、4°Cでオーバーナイトインキュベートするとシグナルと特異性が高くなります。

以下の点に注意してください: 陰性ChIPコントロール

  • 抗体の生産に使用されたのと同じ種の非免疫IgGを、IPインキュベーション混合物中で使用します。

  • IP分画をビーズ(抗体コーティングなし)とインキュベートします。 

ChIPのヒント5: リバークロスリンクIPにおけるIP効率

通常、95°Cで15分間のインキュベーションで十分です。一部のサンプルは、​​65°Cで4時間以上のプロテイナーゼ K処理が必要です。

ChIPのヒント6: DNAの溶出と精製

  • 異なる洗浄バッファー(低塩濃度と高塩濃度バッファー、LiClバッファーとTEバッファー)を使用します。

  • 市販の精製カラムを使用している間、洗浄ステップ後にカラムが完全に乾燥していることを確認してください。水分が残っていると溶出が阻害されます。

  • 必ず溶出バッファーをシリカ膜上に直接置き、少なくとも1分間吸着させてください。

  • 原液から新しい溶液を調製し、汚染を防止します。

  • サンプルが弱いPCRシグナルを示す、またはDNAの増幅を示さない場合は、ヌクレオソームのない領域にまたがるPCR増幅領域のプライマー結果が不十分なためである可能性があります。

  • 以下の点に注意してください:異なるプライマー条件と希釈を使用して、ゲノムDNAのプライマーペアを試験してください。標準/インプットDNAの使用により、プライマーの有効性が決まります。

  • PCR反応に十分なDNAがあり、PCR条件が最適であることを確認してください。必要に応じて、PCR反応にDNAを追加するか、増幅サイクル数を増やします。

  • 複製間のばらつきを避けるために、すべてのサンプルに同量のタンパク質G/A-アガロースまたは磁気ビーズを添加します。ピペッティング中にビーズが十分に懸濁されていることを確認してください。

  • 陽性コントロールには生成物がありませんが、IP反応内に十分なクロマチンまたは抗体があることを確認してください。IPインキュベーション時間が最適化されていることを確認します。

  • タンパク質G/Aビーズからのクロマチンの溶出を完了します。65°Cで頻繁に混合して溶液中にビーズが懸濁した状態を保つと、溶出は最もよくなります(約10分間)。

ChIPのヒント7: 免疫沈降したDNAの分析(PCR増幅)

  • コンタミネーションを避けるために、ストックから新しいソリューションを準備します。

  • PCRサンプルのシグナルが弱い場合や、DNA増幅が見られない場合は、ヌクレオソームのない領域にまたがる不十分なPCR増幅プライマーが原因である可能性があります。

  • 注意:異なるプライマー条件とサンプル希釈倍率で、ゲノムDNAのプライマーペアをテストしてください。スタンダード/インプットDNAによって、プライマーの有効性が決まります。 

  • PCR反応液中に十分なDNAがあり、PCR条件が最適であることを確認してください。PCR反応液にDNAを追加するか、必要に応じて増幅サイクル数を増やします。

  • 反復サンプル間のばらつきを避けるために、全てのサンプルに同量のプロテインG/A-アガロースまたは磁気ビーズを添加してください。ピペッティング中はビーズが十分に懸濁されていることを確認してください。

  • ポジティブコントロールには生成物が無く、IP反応内に十分なクロマチンまたは抗体があることを確認してください。IPインキュベーション時間が最適化されていることを確認します。

  • プロテインG/Aビーズからのクロマチンの溶出を完了します。溶出は65 ℃で最適であり、ビーズを溶液に懸濁させておくために頻繁に混合します(約10分)。


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Posted:
13 June, 2017

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