ヒントとコツ | siRNA トランスフェクションの最適化

siRNA トランスフェクションは、遺伝子制御や分子パスウェイを研究するために使用される強力なツールです。

 
どのように機能するのでしょうか?

副作用を回避しながらsiRNAを高効率で遺伝子導入すると、複数の異なる因子の影響を受けます。次の10のヒントは、siRNAトランスフェクション(遺伝子導入)を最適化するのに役立ちます。

1. プロトコールの最適化

下記の因子は、siRNAトランスフェクションに影響するため、これらの因子を新規の実験毎に最適化する必要があります:

  • 細胞のタイプ
  • 細胞の増殖速度
  • 細胞の密度
  • 細胞の生存能力
  • トランスフェクションの方法
  • siRNAの質/量
  • トランスフェクション時間

2. RNaseフリーの環境

実験を開始する前に、RNase汚染除去溶液で作業スペースを清掃します。siRNAを扱うときは、常にグローブを使用し、表面に触れた後はグローブを交換します。RNaseフリーのチップを装着したピペットを使用し、これらのピペットを他の実験に使用しないようにします。

3. siRNAのデザイン

  • 約21~23 nt(ヌクレオチド)の長さ
  • G/C 含有量: 30~50%
  • 塩基ペアのミスマッチがないこと
  • siRNAはイントロンに結合しないこと
  • 他のコード配列と相同性を示す配列がないこと

4. 新しい標的/siRNA/細胞株での作業

条件を最適化するために、トランスフェクションを複数回試行する準備をしてください。

5. siRNAの対照

結果を正しく解釈するためには、適切な対照を用いることが重要です。

  • 陽性対照:目的とする標的の高度なノックダウンを生み出す既知のsiRNA。
  • 陰性対照:遺伝子発現の非特異的変化の同定に役立つ非サイレンシングsiRNA。
  • 同じ標的に対するもう一つのsiRNA:同じ標的に対する2番目のsiRNAであるが、mRNAの別の領域に対するもので、サイレンシング効果の特異性を証明します。
  • 未処理サンプル:  正常な遺伝子発現レベルを、遺伝子導入していない対照を用いて決定する必要があります。
  • トランスフェクション対照siRNA:  蛍光標識されたsiRNAは、ノックダウン効果の標的設定を簡易化します。
  • モックトランスフェクション対照: siRNAを試用せずトランスフェクション試薬のみでトランスフェクトされた細胞。

6. siRNA データの検証

  • siRNAを滴定:様々な濃度のsiRNAを使用し、製造会社の取り扱い説明を読んで一般的に5~100 nMの濃度を使用します。最低の作業濃度を使用します。
  • RNAおよびタンパク質レベルを監視: mRNAサイレンシングが成功したにもかかわらず、タンパク質濃度がそれに応じて低下しない場合は、タンパク質の代謝回転が遅いことを示唆しています。

7. 細胞培養

細胞は、トランスフェクション時点で、最適な生理的条件にある必要があります。細胞は頻繁に継代する必要があり、トランスフェクションは常に同じ培養条件下で実施する必要があります。通常、トランスフェクション時には約70%の高い細胞密度が必要です。しかし、これは細胞のタイプによって異なり、実験ごとに決定する必要があります。

8. 血清培地と血清フリー培地のどちらを使うか?

ほとんどのトランスフェクション試薬は、siRNA複合体の初期希釈に血清フリー培地を必要とします。トランスフェクションの実施中に血清を細胞培養に添加する場合、その品質/ロットも実験に影響を及ぼす可能性があります。

9. 抗生物質添加培地と抗生物質フリー培地のどちらを使うか?

使用する細胞タイプとトランスフェクション試薬の組み合わせに依存して、トランスフェクション中の細胞透過性は極めて高い感受性を示します。したがって、抗生物質の使用は、細胞死の原因になることがあります。

10.  siRNAサイレンシングの持続期間

一般的に、サイレンシング効果が観察できるのは、最も早くて24時間後です。細胞タイプに応じて、効果は4~7日間持続します。

参考文献

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Posted:
21 June, 2016

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