Myc-Trap®のエピトープ配列とMycタグ融合タンパク質の免疫沈降（IP）
Mycタグの免疫沈降（IP）／共免疫沈降（Co-IP）に最適化されたツールである「Myc-Trap®」製品の特性とあわせて、1xMycタグペプチド／2xMycタグペプチドの選択方法を解説します。
クロモテック（2020年よりプロテインテックの一部）のMyc-Trap®は、Mycタグ融合タンパク質の免疫沈降（IP：Immunoprecipitation）、共免疫沈降（Co-IP：Co-Immunoprecipitation）、アフィニティ精製に最適化された効果的なツールです。目的タンパク質に、単一のMycタグ、すなわち1xMyc（アミノ酸配列：EQKLISEEDL）を融合させるか、あるいは繰り返し配列のMycタグ、すなわち2xMyc（アミノ酸配列：EQKLISEEDLEQKLISEEDL）を融合させるかの違いによって、Myc-Trap®を用いる実験系で求められる溶出方法やプルダウン効率に応じて実験を最適化することができます。本稿では、Myc-Trap®のエピトープ（抗体結合部位）を明らかにするとともに、免疫沈降（IP）、共免疫沈降（Co-IP）、タンパク質精製においてMyc-Trap®が発揮する特性について解説します。
1xMycタグと2xMycタグのどちらを使用すれば良いでしょうか？
Myc-Trap®は、あらゆるMycタグ融合コンストラクトに対して適用でき、免疫沈降（IP）、共免疫沈降（Co-IP）およびタンパク質精製用途に使用できます。その際、タグ融合タンパク質の発現量や下流のアプリケーションに応じて1xMycタグ融合タンパク質または2xMycタグ融合タンパク質のいずれかを戦略的に選択できます。
1xMycタグ融合タンパク質：Myc-Trap®から効率的かつ穏やかな条件で溶出できます
- 1xMycタグ融合タンパク質をMyc-Trap®に結合させた後、2xMycタグペプチドまたは1xMycタグペプチドを用いた穏やかな競合溶出条件でネイティブ状態のタンパク質を溶出できます。
- 尿素（Urea）バッファーを用いて高い効率で目的タンパク質を溶出できます。
- 溶出液の容量を抑えられるため、Mycタグ融合タンパク質を濃縮できます。
2xMycタグ融合タンパク質：効率的にMyc-Trap®ビーズと結合します
- 2xMycタグはMyc-Trap®に対して極めて高い親和性で結合します。
- 発現量が少ない／濃度が低い2xMycタグ融合タンパク質であってもMyc-Trap®によって効率的に捕捉できます。
- 2xMycタグ融合タンパク質は完全にMyc-Trap®と結合するため、高い効率で2xMycタグ融合タンパク質を回収することができます。
- 2xMycタグをMyc-Trap®と結合させた後に厳しい洗浄条件を適用できるため、純度の高いタンパク質を得られます。
2xMycタグの代わりに3xMycタグを使用することも可能です。
パフォーマンスの違いは、2種類のMycタグペプチド配列におけるMyc-Trap®が認識するエピトープと結合様式の違いに起因します
Myc-Trap®を構成する抗MycタグVHH抗体は、ヒトc-Mycタンパク質に由来するMycペプチド（アミノ酸配列：EQKLISEEDL）を認識するように設計されています。プロテインテックは、ペプチドマイクロアレイとアラニンスキャニング解析を使用して抗MycタグVHH抗体が結合するMycペプチド配列のエピトープを決定しました。その結果、抗MycタグVHH抗体が認識する最小のエピトープ配列は「LISEEDL」であることを見出しました。このモチーフの中の、イソロイシン（I）、アスパラギン酸（D）、ロイシン（L）は、抗MycタグVHH抗体の結合に必須のアミノ酸残基です。
EQKLISEEDL
しかし、抗MycタグVHH抗体は2xMycペプチド（アミノ酸配列：EQKLISEEDLEQKLISEEDL）に対してより強固に結合します。この現象は、クロモテックの抗MycタグVHH抗体が2xMycペプチドの2番目のLISEEDLモチーフ配列と強固に相互作用するとともに、最初のEQKLIモチーフ配列とも相互作用するためであると考えられます。
EQKLISEEDLEQKLISEEDL
2xMycペプチド内の2か所で発生する結合イベントの合算により、抗MycタグVHH抗体と2xMycペプチド間で高親和性の相互作用が生じます。抗MycタグVHH抗体と2xMycペプチドの相互作用は、1xMyc融合タンパク質とMyc-Trap®との相互作用と比較して1000分の1程度であり、著しく小さい解離定数（Kd値）を示します（2xMycタグに対するKd値：0.5 nM、1xMycタグに対するKd値：500 nM）。両者の解離定数の値の違いによって、Myc-Trap®に結合した1xMycタグ融合タンパク質は、2xMycタグ融合タンパク質を使用した場合よりも穏やかな条件で溶出することができます。Myc-Trap®の反応速度論に関する考察や、実験デザインのオプションに関する詳細は、プロテインテックのホワイトペーパー「Myc-Trap® for Immunoprecipitation（言語：英語）」をご覧ください。
Myc-Trap®は内在性c-Mycタンパク質に結合しません
Mycタグは、ヒト生体内で細胞周期の進行、アポトーシス、細胞の形質転換に関与する転写因子であるc-Mycタンパク質に由来します。そのため、Myc-Trap®は内在性c-Mycと結合することが懸念されます。しかし、上述したエピトープに関する解析データは、Myc-Trap®がc-Mycタンパク質と結合しない機構を示していると考えられます。抗MycタグVHH抗体との結合に極めて重要なMycタグペプチド内エピトープのいくつかのアミノ酸残基は、実際のc-Mycタンパク質では三次元構造の内部に埋もれています。したがって、ネイティブな状態のc-Mycタンパク質はMyc-Trap®と結合するパートナータンパク質にはなりません。
プロテインテックでは、Nano-Trapのサンプルを無償で提供しています。下記フォームよりご依頼ください。
（※ 国内におけるプロテインテック製品の出荷および販売は、コスモ・バイオ株式会社を通じて行っております。
最寄りのコスモ・バイオ株式会社 代理店をご指定の上、ご依頼ください。）
Myc-Trap®製品の技術と利点
クロモテック（2020年よりプロテインテックの一部）のMyc-Trap®は、VHH抗体（別名：Nanobody®）と呼ばれるアルパカの単一ドメイン抗体に由来する、Mycタグ配列を認識して結合する抗Myc VHH抗体をアガロースビーズ等の担体に結合させた製品です。このアフィニティ樹脂製品を免疫沈降（IP）やアフィニティ精製に適用する場合、従来型のIgG抗体を使用する場合よりも多くの利点を提供します。
- 目的のタンパク質に重鎖や軽鎖によるコンタミネーションが生じません（従来型抗体が結合したアフィニティ樹脂を使用すると、精製後のタンパク質に抗体由来の重鎖や軽鎖が混入する場合があります）。
- Mycタグ融合タンパク質に対して高い特異性・感度・親和性で結合するため、発現量や存在量の少ないMycタグ融合タンパク質であっても、高い効率と再現性でプルダウンまたは精製を実施することが可能です。
［免疫沈降（IP）後のMycタグの検出試験に有用な未標識抗体の紹介］
クロモテックのMycタグ抗体（ラットモノクローナル抗体、カタログ番号：9e1）は、広く利用されているc-Myc（クローン番号：9E10）抗体よりも、ウェスタンブロット（WB）において極めて良好なパフォーマンスを示します。
